Adv Sci | 山东农业大学张大健教授团队单细胞转录组破解大豆结瘤关键通路

大豆作为全球最重要的豆科作物，能够与根瘤菌建立共生固氮体系，将大气中的分子态氮转化为植物可利用的铵态氮，为植株生长和籽粒蛋白质积累提供关键氮源。增强这一固氮效能，有助于削减化学氮肥投入、降低生产成本，同时减少因氮流失造成的环境压力，契合绿色农业的发展目标。然而，根瘤菌侵染早期涉及一系列细胞类型特异性的转录重编程事件，涵盖根表皮细胞的信号感知、侵染线程的形成以及皮层细胞分裂启动根瘤原基等关键步骤，其调控网络尚缺乏系统解析。

2026年7月，山东农业大学张大健教授团队在《Advanced Science》发表题为"Single-cell Transcriptome Profiling Reveals Gene Regulatory Networks and Key Genes in the Root Epidermis and Cortical Cells Associated with Early Nodulation in Glycine Max"的研究论文。该研究采用单细胞转录组测序技术，对接种根瘤菌后第4天的大豆根进行转录谱分析，构建了首个大豆根系与根瘤菌互作初期的单细胞转录组图谱，系统鉴定了参与早期结瘤过程的细胞类型特异性基因。在此基础上，研究进一步鉴定出一条由乙烯信号、WRKY转录因子及其下游Nod19靶基因构成的调控通路。此项工作为理解大豆结瘤的细胞类型特异性调控机制提供了重要数据，也为改良豆科作物共生固氮效率提供了新的基因资源。

研究者通过单细胞测序获得21,500个细胞的转录组数据，经无监督聚类划分为12个细胞群。依据已知细胞类型标记基因的表达特异性，成功注释了表皮细胞、皮层细胞、维管细胞、韧皮部细胞、内皮层细胞等主要根细胞类型。其中感染细胞群仅在接种组中大量存在（占12.9%），而在对照组中近乎缺失（0.8%），且该群在独立聚类中保持稳定，表明其为根瘤菌侵染后新出现的细胞状态。该图谱为后续细胞类型特异性差异表达分析奠定了可靠基础。

图1. 大豆根早期结瘤单细胞转录组图谱

在11种共有的细胞类型中，表皮细胞（397个）与皮层细胞（360个）拥有的差异表达基因数量最多，占全部差异基因的近半数。基因本体富集分析显示，表皮细胞特异性差异基因主要富集于解毒、蛋白稳态及氧化应激响应，提示其在侵染界面执行防御缓冲功能；而皮层细胞特异性差异基因则富集于物质转运、呼吸电子传递、氧化还原平衡及乙烯相关激素信号，表明皮层细胞在代谢层面为根瘤原基形成提供支持。两类细胞富集通路的差异，特别是硝酸盐相关通路的相反富集方向，支持了它们在结瘤过程中的功能分工。

图2. 早期结瘤过程中细胞类型特异性差异表达基因鉴定

对感染细胞进行独立分析表明，该细胞群并非均一来源，约15.7%呈现表皮样特征，21.1%呈现皮层样特征，其余为混合型。与所有其他细胞类型相比，感染细胞特异性基因主要富集于种间互作、防御响应、蛋白酶体降解及水杨酸信号通路。与表皮细胞相比，感染细胞在伤害响应、茉莉酸及防御调控通路中富集程度更高，而谷胱甘肽代谢富集程度更低；与皮层细胞相比，感染细胞同样显示更强的伤害与茉莉酸相关过程，但呼吸电子传递富集减弱。上述结果支持感染细胞处于一种介于表皮与皮层之间的特化共生状态。

图3. 感染细胞与各细胞类型的差异表达基因GO富集比较

基于单细胞数据构建的基因调控网络显示，转录因子GmWRKY6.3与GmWRKY6.4处于调控枢纽位置，其预测靶基因包括GmNod19-19与GmNod19-23。表达模式分析表明，GmWRKY6.3在皮层、维管及感染细胞中高表达，GmWRKY6.4在皮层、维管及韧皮部细胞中表达，而GmNod19-23特异性表达于表皮细胞，GmNod19-19则广泛分布于皮层及各类细胞。过表达GmWRKY6.3或GmWRKY6.4可显著上调两个Nod19靶基因的表达，而RNA干扰则导致其表达下调，证实二者为正调控关系。

图4. 基因调控网络的构建与核心模块鉴定。

染色质免疫沉淀-定量PCR实验显示，GmWRKY6.3可直接结合GmNod19-19与GmNod19-23的启动子区域，而GmWRKY6.4仅结合GmNod19-23启动子。电泳迁移率变动分析进一步证实了上述结合的特异性。双分子荧光互补、酵母双杂交及荧光素酶互补成像实验均证实GmWRKY6.3与GmWRKY6.4可在细胞核内形成异源二聚体。双荧光素酶报告实验表明，二者共表达对GmNod19-19启动子的激活效应显著强于GmWRKY6.3单独表达，提示GmWRKY6.4通过蛋白互作增强GmWRKY6.3的转录激活功能。

图5. GmWRKY6.3/6.4对GmNod19靶基因的直接调控及蛋白质互作验证

转基因毛状根表型分析显示，过表达以上四个基因均可显著增加根瘤数量，而RNA干扰则导致根瘤数量显著减少，其中GmNod19-23的调控效应最为显著。时间表达谱分析表明GmNod19-23在接种后第2天表达急剧上升，至第7天逐渐回落。在GmNod19-23沉默株系中，侵染线程标记基因GmRj1与GmRj5表达下调，而早期信号及根瘤原基标记基因表达无显著变化。直接计数证实，沉默株系的侵染焦点与侵染线程数量显著减少。上述结果将该基因的功能定位在侵染线程形成阶段，而非上游信号感知或根瘤器官发生阶段。

图6. GmWRKY6.3/6.4及GmNod19-19/23的体内功能验证

外源施加乙烯前体ACC可显著上调GmWRKY6.3、GmWRKY6.4及GmNod19-19/23的表达，并减少侵染焦点、侵染线程及最终根瘤数量；而施加乙烯合成抑制剂AVG则产生相反效果。通过RNA干扰同时沉默根中高表达的乙烯合成酶基因GmACS1与GmACS2，内源乙烯水平及合成速率显著降低，同时该调控回路中四个基因的表达均显著下调，且侵染线程与根瘤数量减少。上述结果证实乙烯作为上游信号，通过该通路对结瘤发挥调控作用，且该效应在不同大豆品种中存在差异。

图7. 乙烯通过GmWRKY6.3/6.4-Nod19通路调控结瘤。

系统发育分析显示，Nod19家族在豆科中发生显著扩增，但在其他固氮分支中未观察到类似现象。大豆基因组编码24个Nod19蛋白，但单细胞数据中仅检测到5个表达，其中仅GmNod19-19与GmNod19-23响应根瘤菌侵染。序列分析表明，功能相关的Nod19基因在启动子区含WRKY结合位点，而扩增拷贝则缺乏这些顺式元件，且其基因座附近存在转座子插入，可能介导了基因沉默。局部基因重复与转座子介导的重排是扩增的主要机制，功能分化主要源于启动子区域序列差异而非蛋白结构改变。

图8. Nod19超家族的进化与扩增分析。