南京农业大学丨功能性绵羊子宫内膜腔上皮类器官的建立与表征

胚胎成功植入依赖于子宫在特定时空窗口内形成容受性状态。腔上皮作为胚胎首先接触的母体界面，通过黏附分子表达、趋化因子分泌和外泌体释放，在建立植入微环境中起核心作用。绵羊是研究反刍动物生殖生理的重要模型，其胚胎以非侵入性方式附着于子宫肉阜区域的腔上皮。然而，现有体外模型面临显著局限：二维培养无法再现子宫内膜的三维复杂性，而目前的类器官系统主要来源于腺上皮，腔上皮特异性类器官长期缺失。这是由于腔上皮细胞在子宫内膜中比例低、干细胞潜能差，且常规消化方法难以有效区分两种上皮亚型。反刍动物子宫肉阜区域天然无腺体结构，为分离纯腔上皮细胞提供了独特的解剖学优势。

来自南京农业大学的研究团队在《Veterinary Research》期刊上发表题为Development and characterization of functional sheep endometrial luminal epithelial organoids的文章，团队利用绵羊子宫肉阜组织，通过系统筛选培养基组分（CHIR99021、Y-27632、SB202190和EphrinA1配体），成功建立了稳定的三维腔上皮类器官培养体系。该类器官具有极化结构、黏液分泌能力和腔上皮标志物表达，并成功构建了顶面向外极性模型。转录组分析证实类器官与天然腔上皮高度相似，功能验证显示其能促进囊胚扩张和滋养层增殖，并表现出激素增强的底物特异性黏附能力。

图：绵羊子宫内膜腔上皮类器官培养体系的优化与建立

该图展示了从绵羊子宫肉阜分离腔上皮细胞并在Matrigel中建立三维类器官的全流程。研究者系统筛选了九种培养基配方（T1-T9），定量分析显示，CHIR99021（WNT激活剂）、Y-27632（ROCK抑制剂）、SB202190（p38 MAPK抑制剂）和EphrinA1-Fc配体的组合（即ExM配方）产生了最高的类器官形成效率和最大的平均直径（超过100 μm）。生长因子撤除实验表明，去除EGF、NOG、FGF10、A83-01或HGF会显著减小类器官直径，而RSPO1的去除无显著影响，证实其在该体系中为非必需因子。该优化方案支持类器官稳定传代至少8代，Ki-67免疫荧光证实第8代仍保持高增殖活性。该图确立了绵羊腔上皮类器官培养的最佳条件，并首次将EphrinA1/EphA信号引入子宫类器官培养体系。

图：腔上皮类器官的表型与分子特征

该图对类器官进行了全面的形态学和分子鉴定。H&E染色显示类器官形成典型的含腔结构，PAS染色证实其分泌大量黏液至腔隙，表明功能成熟。透射电镜观察到极化上皮的特征性超微结构，包括顶端微绒毛、细胞间桥粒和分泌囊泡。免疫荧光显示类器官高表达腔上皮标志物KRT-18、TROP2和EpCAM，且所有类器官均不表达腺上皮标志物FOXA2，证实了腔上皮纯度。SOX9和FOXJ1的表达分别指示干细胞群和纤毛细胞谱系的存在。转录组分析显示，添加EphrinA1-Fc显著上调了干性相关基因（SOX9、LGR5、CD44、AXIN2、CDH2）的表达，首次揭示了EphA信号在调节绵羊子宫内膜类器官干细胞特性中的功能作用。

图：子宫内膜类器官的多维功能分析

该图验证了类器官支持胚胎发育和促进滋养层增殖的功能。将孵化囊胚与顶面向外类器官在非接触共培养体系中培养4天后，囊胚直径显著增加20.25%，提示类器官分泌的因子支持胚胎发育。Transwell间接共培养显示，类器官分泌因子使滋养层细胞S期比例呈增加趋势。类器官与滋养层细胞的黏附动力学分析表明，类器官在滋养层单层上6小时内完全黏附，在子宫内膜基质细胞上需8小时，在纤维连接蛋白包被培养皿上需16小时，在普通培养板上16小时仅刚启动黏附。激素预处理（E2、E2+MPA、E2+MPA+IFN-τ）显著增强了类器官对细胞外基质的黏附能力，其中E2+MPA和E2+MPA+IFN-τ处理组在4小时内黏附细胞数最多。该图证明该类器官不仅结构上模拟天然腔上皮，而且在功能上能够响应激素、支持胚胎发育并介导胚胎-母体黏附。

本研究利用绵羊子宫肉阜天然无腺体的结构优势，通过系统优化培养基组分（特别是首次引入EphrinA1配体），成功建立了稳定的绵羊子宫内膜腔上皮类器官。该类器官在结构上具有极化腔上皮特征（微绒毛、桥粒、分泌囊泡），表达KRT-18/TROP2/EpCAM等腔上皮标志物，且不污染腺上皮标志物FOXA2。通过将类器官释放至超低吸附板悬浮培养，成功构建了顶面向外极性模型，其顶面朝外更接近体内腔上皮的天然取向。转录组分析证实类器官与天然腔上皮高度相似，且对雌激素、孕激素和干扰素-τ的激素响应与体内一致。功能实验表明，类器官分泌的因子可促进囊胚扩张和滋养层增殖，并在激素预处理下增强对滋养层和细胞外基质的黏附能力。该模型为研究反刍动物胚胎植入机制、筛选改善繁殖效率的治疗策略提供了可靠的体外平台，也为子宫内膜相关疾病（如子宫内膜异位症、容受性缺陷）的研究提供了新工具。

参考文献

Guo, J., Huang, X., Xia, R., Gao, Q., Yang, H., Wang, L., Mai, Q., Deng, M., Zhang, G., Zhang, Y., & Wang, F. (2026). Development and characterization of functional sheep endometrial luminal epithelial organoids. Veterinary Research, 57, 102.

https://doi.org/10.1186/s13567-026-01764-4

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