HR(Q1/8.5)|中国农业大学张蕴薇教授团队揭示紫花苜蓿m⁶A甲基转移酶MsMTA调控碳氮代谢平衡的分子机制

3.1 MsMTA是紫花苜蓿中m⁶A甲基化必需的核定位蛋白

• 序列与表达：MsMTA含有保守的MT-A70甲基转移酶结构域，在根、成熟叶和根瘤组织中具有较高的表达丰度。

• 亚细胞定位：烟草瞬时表达试验的荧光信号表明，MsMTA蛋白特异性定位于细胞核内。

• 功能验证：构建RNAi和过表达株系后，RNA斑点杂交证实MsMTA敲降会显著降低整体m⁶A水平，表明其为m⁶A沉积所必需。

MsMTA作为MTA/METTL3的同源物，具有典型的甲基转移酶结构域且定位于细胞核。通过构建并筛选出具有显著沉默效率的RNAi株系和高表达的过表达株系，进一步的RNA斑点杂交分析证实，抑制MsMTA表达会大幅度降低紫花苜蓿总RNA的m⁶A修饰丰度，确立了其在m⁶A甲基化过程中的核心功能地位。（Fig.1）

图1. MsMTA的功能分析。(A) MsMTA在紫花苜蓿不同组织中的表达模式。R，10天苗龄的根；Sh，10天苗龄的茎；Sl，10天苗龄的单叶；Yl，幼叶（折叠叶）；Ml，成熟叶（展开叶）；St，茎；Yf，幼花；Mf，成熟花；N，根瘤。(B) MsMTA的亚细胞定位。35S:GFP作为阳性对照。GFP：绿色荧光蛋白。比例尺=50 μm。(C) MsMTA-RNAi紫花苜蓿株系中MsMTA的相对表达水平。(D) MsMTA-RNAi紫花苜蓿株系总RNA m⁶A修饰水平的检测。(E) 使用ImageJ测量相对光密度，对(D)中斑点杂交的m⁶A修饰进行定量。

3.2 关键m⁶A甲基转移酶MsMTA调控紫花苜蓿的生长发育与营养品质

• 生长受抑：MsMTA沉默导致植株显著矮化，表现为节间缩短、茎变细及干物质积累减少，但叶片发育无显著差异。

• 营养改变：RNAi株系呈现出可溶性糖显著增加、粗蛋白和酸性洗涤纤维适度降低的“高糖、低蛋白、低纤维”特征。

• 过表达表型：过表达株系在株高、茎粗、节间长度及各项营养品质指标上与野生型相比均无显著差异。

抑制MsMTA表达主要限制了紫花苜蓿茎的伸长与增粗，导致植株呈现明显的矮化表型及干物质积累减少。同时，该基因的沉默重塑了碳氮营养分配，使得植株形成可溶性糖升高而粗蛋白和酸性洗涤纤维降低的特定营养特征。这些结果表明MsMTA不仅调控茎的发育，还深刻影响碳氮代谢与细胞壁成分的沉积，而其过表达则不足以引起显著的表型改变。（Fig.2）

图2. 沉默MsMTA限制紫花苜蓿茎生长并改变营养组成。(A) 10周龄野生型（WT）植株与三个独立MsMTA-RNAi株系（#13、#17和#31）的节间长度比较。误差线表示至少五个生物学重复的标准差（SD）。(B) WT和MsMTA-RNAi紫花苜蓿植株的生长表型。比例尺=5 cm。(C) WT和MsMTA-RNAi株系茎形态的比较。比例尺=5 mm。(D) WT和MsMTA-RNAi植株茎粗的定量。(E) WT和MsMTA-RNAi植株干物质含量的测定。(F) 显示WT和MsMTA-RNAi株系10周内株高的生长曲线。(G) WT和MsMTA-RNAi株系可溶性糖含量的测定。(H) WT和MsMTA-RNAi株系中性洗涤纤维（NDF）含量的测定。(I) WT和MsMTA-RNAi株系酸性洗涤纤维（ADF）含量的测定。(J) WT和MsMTA-RNAi株系粗蛋白（CP）含量的测定。

3.3 MsMTA对紫花苜蓿全转录组m⁶A甲基化模式的影响

基于纳米孔直接RNA测序（ONT-DRS）的全转录组分析揭示，紫花苜蓿的m⁶A修饰广泛分布于染色体末端，并高度富集于转录本的3′非翻译区（3′UTR），且以“GAACU”为核心识别基序。MsMTA的表达抑制不仅导致全基因组水平m⁶A修饰位点总量的急剧下降，还引发了修饰分布从编码区（CDS）向3′UTR的显著偏移，证实了MsMTA在塑造全转录组m⁶A修饰格局中的核心调控地位。（Fig.3）

图3. WT和MsMTA-RNAi株系中m⁶A修饰位点的分布分析。(A) 显示WT和MsMTA-RNAi株系中m⁶A修饰位点的分布，颜色梯度代表m⁶A修饰密度，颜色越深表示修饰位点密度越高，颜色越浅表示密度越低。(B) 比较WT和MsMTA-RNAi株系中m⁶A修饰位点数量的条形图。(C) 密度图说明了WT和MsMTA-RNAi株系中5′UTR、CDS和3′UTR区域m⁶A修饰位点的分布，突出了两者之间的差异。(D) 条形图显示了m⁶A峰在不同转录本区域（包括编码区CDS、5′和3′非翻译区UTR以及起始和终止密码子附近）的比例分布，比较了WT和MsMTA-RNAi。(E) 代表WT和MsMTA-RNAi株系样本中主要m⁶A修饰基序的序列标识图。

3.4 MsMTA介导的m⁶A对紫花苜蓿基因表达和代谢通路的调控

转录组与表观转录组的综合分析表明，MsMTA沉默引发了广泛的基因表达重塑和m⁶A甲基化水平下降。差异表达基因高度集中在光合色素代谢与细胞壁结构发育网络中，而差异甲基化基因则主要富集于能量代谢、囊泡运输及有机酸代谢等通路。这些结果表明，MsMTA通过转录与表观转录层面的双重调控，深度参与光合活性与生物量形成所需代谢过程的协调，进而影响植株的茎发育与营养分配。（Fig.4）

图4. MsMTA-RNAi条件下紫花苜蓿的差异基因表达与m⁶A修饰。(A) 显示紫花苜蓿（WT对比MsMTA-RNAi）差异基因表达的火山图。红点表示显著上调的基因，蓝点表示显著下调的基因。显著性定义为绝对|log₂(Fold Change)| > 1且FDR < 0.05。(B) 差异表达基因（DEGs）的GO富集分析，显示前20个富集的生物学通路。基因比率表示每个通路中DEGs占分配给该通路总基因数的比例。(C) 显示紫花苜蓿（WT对比MsMTA-RNAi）差异m⁶A修饰的火山图。红点代表显著上调的基因，蓝点代表显著下调的基因。显著性定义为绝对|log₂(Fold Change)| > 1且Score > 3。(D) 差异m⁶A修饰基因的GO富集分析，显示前20个富集的生物学通路。基因比率表示每个通路中差异修饰基因占该通路总基因数的比例。

3.5 MsMTA通过m⁶A介导的调控调节氧化还原、小分子代谢和有机氮生物合成通路

将差异表达基因与差异甲基化基因进行交叉比对，发现超过半数的重叠基因表现出甲基化降低伴随表达量下降的“Hypo-Down”模式。这些基因在氧化还原稳态、小分子代谢及氮素同化等关键通路中高度富集。特别是GS2、SDR1、ATPC2等涉及光合电子传递与能量平衡的核心基因，其m⁶A修饰的缺失直接导致了转录本的下调。这表明MsMTA依赖的m⁶A修饰对于维持光合效率及全局细胞代谢稳态具有决定性作用，其功能缺失引发的代谢减弱是导致植株生长受抑的重要驱动因素。（Fig.5）

图5. m⁶A修饰与基因表达的关联分析。(A) 差异m⁶A修饰基因（m⁶A-DEGs）与差异表达基因（DEGs）的重叠分析。(B) 说明m⁶A甲基化变化与基因表达之间相关性的象限图。甲基化增加且上调的基因标记为‘Hyper-up’，甲基化增加且下调的基因标记为‘Hyper-down’，甲基化减少且上调的基因标记为‘Hypo-up’，甲基化减少且下调的基因标记为‘Hypo-down’。(C) ‘Hypo-Down’象限中基因的GO富集分析，突出显示富含低甲基化和下调基因的前10个通路。(D) 热图显示参与氧化还原过程、小分子代谢过程和有机氮化合物生物合成过程的差异表达基因（DEGs）的m⁶A甲基化水平与转录本丰度之间的相关性。标注了关键代表性基因，包括短链脱氢酶/还原酶1（SDR1）、脂氧合酶3（LOX3）、丝氨酸羧肽酶样22（SCPL22）、ATP合酶γ亚基2（ATPC2）、谷氨酰胺合成酶2（GS2）和腺嘌呤磷酸核糖转移酶1（APT1）。

3.6 MsMTA-RNAi株系中代表性基因m⁶A富集、转录本水平及mRNA稳定性的验证

为了验证高通量测序的可靠性及探究转录后调控机制，采用m⁶A-IP-qPCR和RT-qPCR对三大核心代谢通路中的代表性基因（如MsSDR1、MsLOX3、MsSCPL22、MsATPC2、MsGS2和MsAPT1）进行了定量分析。结果不仅证实了这些基因在MsMTA敲降背景下m⁶A修饰丰度与转录表达量的双重下降，更通过放线菌素D抑制试验明确揭示了其mRNA降解速率的显著加快。综合表明，MsMTA主要通过维持m⁶A依赖的mRNA稳定性来调控下游靶基因的表达，进而掌控紫花苜蓿的全局代谢网络。（Fig.6）

图6. MsMTA-RNAi紫花苜蓿中参与三大主要代谢通路的基因的m⁶A修饰水平、转录本丰度和mRNA稳定性变化的验证。(A) 通过m⁶A免疫沉淀结合定量PCR（m⁶A-IP-qPCR）测定与氧化还原过程（MsSDR1、MsLOX3）、小分子代谢过程（MsSCPL22、MsATPC2）和有机氮化合物生物合成过程（MsGS2、MsAPT1）相关基因的m⁶A富集水平。(B) 使用MsACTIN作为内参基因，通过RT-qPCR定量这些基因的相对表达水平。(C) 为了评估mRNA稳定性，用50 μg/mL放线菌素D处理野生型和MsMTA-RNAi植株，并在不同时间点提取RNA进行RT-qPCR分析。MsACTIN被用作内参。数据以三个生物学重复的平均值±SEM表示。星号表示差异显著（P < 0.05，Student's t检验）。