Food Chem. | 南京农业大学黄明教授等:樱桃谷鸭肉提取物中新型鲜味肽的鉴定、感官表征及其味觉感知机制研究

鲜味是5 种基本味型之一，对于食物的感官辨别至关重要。鲜味化合物通过结合T1R1/T1R3受体（taste 1 receptor member 1/3）并触发愉悦神经通路来提升食物的适口性。自1908年池田菊苗发现谷氨酸钠（monosodium glutamate，MSG）作为一种鲜味物质以来，它已被广泛用作风味增强剂。然而，由于人们对MSG可能带来的副作用（如口渴）日益关注，促使了对天然鲜味替代物的寻找。其中，鲜味肽因其独特的风味、安全性和天然来源而受到关注。目前已在牛肉、鸡肉、食用菌、罗非鱼和酵母等来源中发现了这些通常分子质量小于3000 Da的小肽。然而，关于鸭肉中鲜味肽的研究仍然缺乏。

南京盐水鸭是一种受保护的地理标志产品，通过干腌、卤制、成熟和烹煮制成。其独特的鲜味源于成熟过程中内源性酶将蛋白质分解为肽和游离氨基酸。尽管已有大量研究通过外源酶水解从禽肉中提取鲜味肽，但对于成熟过程中内源酶消化如何产生这些肽的了解仍然有限。传统的鉴定方法通常依赖于多步纯化后进行感官评价，往往效率低下、成本高昂，且易导致肽活性损失。近年来，结合分子对接、机器学习和分子动力学模拟的集成计算机方法已成为理解分子机制的标准手段，并在纳米材料抗菌效应研究、酶功能预测和天然产物生物活性评估等多个领域得到成功应用，证明了其广泛的适用性。这种跨学科验证为新型鲜味肽的靶向鉴定及其与T1R1/T1R3受体结合行为的系统研究提供了坚实框架，凸显了计算方法在分析分子相互作用中的可靠性。

南京农业大学食品科学技术学院Hua Yu等鉴定鸭肉成熟过程中内源蛋白水解产生的鲜味肽，并阐明其分子机制。研究采用了超滤、感官评价和电子舌分析来筛选鲜味成分，利用液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）鉴定肽序列，运用机器学习和分子对接进行预测性筛选，随后合成了候选肽进行验证。

在15 ℃、70%相对湿度的成熟过程中，鸭胸肉中分子质量小于3 kDa的肽段（U1组分）含量随成熟时间延长显著增加（0～5 d），并在第3天后增速放缓。

圆二色光谱分析显示，蛋白质二级结构发生改变，α-螺旋含量从77.4%下降至62.9%，而无规卷曲含量从10.7%上升至19.8%，表明蛋白质天然结构被破坏。

A.超滤馏分鲜味强度感官评价；B.超滤组分鲜味强度电子舌分析；C. U1部分多肽含量测定；D.粗肽二级结构分析。字母不同，表示差异显著（P＜0.05）。下同。

图1 鸭胸水提取物超滤馏分鲜味强度及肽特性评价

通过LC-MS/MS从U1～3组分中鉴定出366 条肽段。使用5 种机器学习工具进行共识预测，筛选出98 条潜在鲜味肽。进一步通过鲜味片段频率（≥0.5000）、良好水溶性和无毒性的标准过滤，最终得到29 条候选肽用于分子对接分析。

使用AlphaFold2-Multimer成功构建了T1R1/T1R3异源二聚体的三维模型。模型质量评估显示，配体结合口袋和跨膜螺旋等关键功能区域的残基具有较高的局部置信度（pLDDT＞90）。预测结构（尤其是包含正构配体结合位点的VFTD）与实验测定的C类GPCR（CaSR）结构高度一致（RMSD为1.826 Å），验证了模型的准确性。

A.结构模型上的pLDDT分数图；B.每个残基的pLDDT分数图；C.预测对齐误差热图；D.与钙敏感受体CaSR（PDB编号：7M3F）的结构比对。

图2 鲜味受体T1R1/T1R3模型的构建与验证

确定了T1R1亚基VFTD内的一个关键结合口袋用于对接研究，该口袋具有最大的体积和表面积。使用MSG和已知鲜味肽AFDVQ进行验证性对接，结果与文献报道一致，证明了对接策略的合理性。对29 条候选肽进行对接，结合能范围为－9.3～－6.9 kcal/mol。筛选出结合能最低的6 条肽（RVEVNIL、DDVIQTGVDNP、HTEVNVPRSGETEEL、NIEEKSGMEG、EKERIEAQNKPFDA、TLGEKMTEEEVDE）进行深入研究。

6 条合成肽均显示出鲜味，且强度高于相同含量的MSG。其中TLGEKMTEEEVDE和RVEVNIL鲜味强度最高，而DDVIQTGVDNP鲜味较弱。6 条肽的鲜味检测阈值在0.09～0.30 mmol/L之间，与其他来源的鲜味肽阈值范围相似。鲜味强度高的肽（如TLGEKMTEEEVDE）通常含有较高比例的亲水性和鲜味相关氨基酸。6 条肽的二级结构均以无规卷曲为主。除NIEEKSGMEG外，其余5 条肽的β-折叠含量低于无规卷曲或β-转角。

A.合成肽鲜味强度的感官评价；B.电子舌测定合成肽的鲜味强度；C.合成肽中各种氨基酸的组成分析；D.合成肽的二级结构分析。

图3 鲜味强度、氨基酸组成及合成肽二级结构的分析

表1 筛选出潜在的鲜味肽的基本信息

所有6 条肽均成功对接在T1R1的VFTD内。确定了一个包含44 个氨基酸残基的结合位点，其中His308、Arg277、Asp108、Asn69、Arg307、Ser48、Gln278、His71和Glu70在与所有肽的对接中均高频出现，为关键潜在结合位点。氢键是主要的相互作用力，此外静电相互作用和疏水相互作用也对复合物稳定性有重要贡献。

A～F.分别为肽DDVIQTGVDNP、EKERIEAQNKPFDA、HTEVNVPRSGETEEL、NIEEKSGMEG、RVEVNIL和TLGEKMTEEEVDE与T1R1的分子对接构象；G. 6 种肽与T1R1分子对接的活性氨基酸残基结果汇总；H. 6 种肽与T1R1之间的关键相互作用力及其出现频率。

图4 6 种肽与鲜味受体T1R1相互作用的分子对接分析

TLGEKMTEEEVDE、RVEVNIL和NIEEKSGMEG与T1R1形成的复合物在100 ns模拟中构象稳定、结构紧凑。而DDVIQTGVDNP等肽的复合物则引发了受体VFTD域的构象重排和“开放”状态。

A～D.分别为根均方偏差、旋转半径、可溶性表面积以及氢键数量随时间的变化情况；E1～E6.分别为T1R1与肽段DDVIQTGVDNP、EKERIEAQNKPFDA、HTEVNVPRSGETEEL、NIEEKSGMEG、RVEVNIL和TLGEKMTEEEVDE复合物的三维和二维自由能景观。

图5 基于100 ns分子动力学模拟对鲜味肽-T1R1复合物的系统稳定性及自由能景观分析

MM/PBSA计算得到的结合自由能排序为：TLGEKMTEEEVDE＞RVEVNIL＞HTEVNVPRSGETEEL＞NIEEKSGMEG＞EKERIEAQNKPFDA＞DDVIQTGVDNP。此顺序与感官评价的鲜味强度趋势一致。静电相互作用是稳定TLGEKMTEEEVDE结合的主要驱动力。能量分解分析表明，Arg277、Ser306和Arg307在所有体系中均是贡献度高的热点残基。

A.每个复合物的总结合自由能；B.将总结合自由能分解为各个能量成分；C～H.分别为T1R1与肽段DDVIQTGVDNP、EKERIEAQNKPFDA、HTEVNVPRSGETEEL、NIEEKSGMEG、RVEVNIL和TLGEKMTEEEVDE复合物的每个残基的自由能分解。

图6 MM/PBSA对6 种鲜味肽与T1R1受体之间结合自由能的分析

TLGEKMTEEEVDE诱导受体域“闭合”，形成稳定广泛的极性相互作用网络（“全局稳定，精确锁定”模式）；而DDVIQTGVDNP则导致受体构象扰动，结合较浅（“局部优化，整体扰动”模式）。

DDVIQTGVDNP-T1R1：A. 0 ns时的叠加结构和100 ns时的叠加结构；B.结合口袋的构象变化；C. 100 ns时的相互作用图。TLGEKMTEEEVDE-T1R1：D. 0 ns时的叠加结构和100 ns时的叠加结构；E.结合口袋的构象变化；F. 100 ns时的相互作用图。

图7 对分子动力学模拟中0 ns和100 ns时的肽-T1R1复合物进行的可视化分析

本研究针对鸭肉成熟过程中小肽产量增加且鲜味增强的现象，通过机器学习预测、分子对接及感官验证，成功筛选出6 种源自鸭肉的新型鲜味肽。其中，TLGEKMTEEEVDE表现出最高的鲜味强度，其阈值为0.09 mmol/L。通过分子动力学模拟结合MM/PBSA结合自由能计算，系统阐明了鲜味肽与T1R1受体的相互作用机制。研究结果表明，稳定的结合主要通过静电相互作用和氢键网络实现，其中Arg277、Ser306和Arg307被确定为关键结合残基。

为汇聚全球智慧共探产业变革方向，搭建跨学科、跨国界的协同创新平台，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心、国家市场监督管理总局技术创新中心（动物替代蛋白）、中国食品杂志社《食品科学》杂志（EI收录）、中国食品杂志社《Food Science and Human Wellness》杂志（SCI收录）、中国食品杂志社《Journal of Future Foods》杂志（ESCI收录）主办，西南大学、重庆市农业科学院、重庆市农产品加工业技术创新联盟、重庆工商大学、重庆三峡学院、西华大学、成都大学、四川旅游学院、西昌学院、北京联合大学协办的“第三届大食物观·未来食品科技创新国际研讨会”，将于2026年4月25-26日（4月24日全天报到）在中国 重庆召开。

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