2026年1月，河北农业大学袁万哲教授团队在期刊《Poultry Science》（IF：4.2）在线发表题为：Duck intestinal organoids: A novel model for waterfowl parvovirus infection and immune responses investigation 的高水平研究论文。
水禽细小病毒的研究主要利用水禽胚胎和水禽成纤维细胞。然而，水禽胚胎难以处理，水禽成纤维细胞并非病毒的真正靶细胞，且可能不反映实际体内环境，这使得获得准确结果变得困难。
在这项研究中，我们首先开发了鸭肠类器官，这些类器官包含不同类型的上皮细胞，包括肠细胞、肠道干细胞、潘奈斯细胞和杯状细胞等。为验证肠道类器官对水禽细小病毒的易感性，建立了鸭类肠道类器官单层和顶端出肠类器官，并接种了新型鹅细小病毒（NGPV）。
我们的结果表明，两种肠道类器官模型都能支持强健的NGPV复制。此外，北性腺细胞分裂病毒感染显著上调肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、IL-6、干扰素-α（IFN-α）、IFN-β和粘液病毒耐药蛋白（MX）表达。
我们首先建立了鸭肠类器官单层和顶端外出类器官，用于水禽细小病毒感染和免疫反应研究。本研究为未来细小病毒研究提供了新颖且可靠的感染模型。
1. 首次建立鸭肠道类器官模型，突破水禽肠道类器官培养技术空白，为禽类病毒研究提供新平台。
2. 构建鸭肠道类器官单层培养体系，实现二维条件下高效培养与连续传代，优于传统鸭胚成纤维细胞。
3. 首创极性翻转的顶向外出型鸭肠道类器官，模拟肠道天然感染途径，更真实反映病毒入侵机制。
4. 证实新型鹅细小病毒在两种类器官模型中均可高效复制，病毒载量显著高于传统细胞系。
5. 揭示NGPV感染可激活天然免疫应答，上调TNF-α、IL-6、IFN-β等细胞因子及MX蛋白表达，为抗病毒机制研究奠定基础。
水禽细小病毒包括鹅细小病毒、番鸭细小病毒和新型鹅细小病毒，主要感染水禽肠道，引起肠道炎症、紧密连接破坏、肠道菌群失调及严重腹泻，给全球水禽产业造成重大经济损失。目前该病毒研究主要依赖水禽胚胎和鸭胚成纤维细胞，但胚胎操作技术复杂，成纤维细胞并非病毒天然靶细胞，难以真实反映病毒-宿主相互作用。肠道类器官自2009年从小鼠Lgr5+干细胞成功建立以来，因其保留肠道上皮隐窝形态特征、具备自我更新和分化能力、可模拟体内肠道微环境，已成为研究病毒-宿主相互作用的理想体外平台。猪肠道类器官已用于研究传染性胃肠炎病毒，马小肠类器官支持马冠状病毒复制，鸡肠道类器官对低致病性禽流感病毒易感，但水禽肠道类器官尚未建立，极大限制了水禽病毒研究。本研究首次建立鸭肠道类器官及其单层和顶向外出型两种培养体系，为揭示水禽细小病毒感染机制和免疫应答提供了新型生理相关模型。
1. 鸭肠道类器官培养：取1日龄鸭空肠段，EDTA消化分离隐窝，Matrigel包埋培养，添加Y-27632和鸭血清的类器官生长培养基维持，3天形成3D类器官。
2. 类器官单层建立：5天类器官经TrypLE消化为单细胞，接种于Matrigel预包被的48孔板，3天形成融合单层用于后续感染实验。
3. 顶向外出型类器官制备：5天类器官经冷EDTA解离，低吸附培养板悬浮培养3天，获得极性翻转的顶向外出型类器官。
4. 病毒感染实验：以MOI=1接种NGPV，37℃吸附2小时（单层）或1小时（顶向外出型），PBS洗涤后换液培养，于24、36、48小时收集样本。
5. 病毒载量检测：RT-qPCR采用TaqMan探针法检测NGPV拷贝数，TCID50测定病毒滴度。
6. 免疫荧光染色：4%多聚甲醛固定，0.1% Triton X-100透化，一抗（Villin、Lgr5、MUC2、LYZ、ZO-1、NGPV VP3）4℃过夜，荧光二抗室温1小时，DAPI染核，激光共聚焦显微镜观察。
7. 免疫因子检测：RT-qPCR检测TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-α、IFN-β、MX mRNA水平，ELISA测定培养上清中TNF-α、IL-6、IFN-β蛋白浓度。
Figure 1展示了鸭肠道类器官的建立与鉴定。图A为从鸭空肠隐窝分离培养类器官的示意图；图B显示培养3天后形成具有隐窝-绒毛结构的3D类器官；图C通过免疫荧光染色证实类器官包含多种上皮细胞类型，包括Villin阳性的吸收性肠上皮细胞、Lgr5阳性的干细胞、MUC2阳性的杯状细胞和LYZ阳性的潘氏细胞，表明该模型具有多细胞复杂性。
Figure 2验证了鸭肠道类器官单层对NGPV的易感性。图A显示成功建立的类器官单层形态；图B和C通过RT-qPCR和TCID50检测表明，NGPV在类器官单层中的复制效率高于鸭胚成纤维细胞，病毒载量在36小时达到峰值；图D的免疫荧光结果显示NGPV VP3蛋白在36小时实现完全感染。
Figure 3展示了NGPV感染诱导的天然免疫应答。图A-F显示感染后TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-α、IFN-β和MX的mRNA水平显著上调，其中TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-α在36小时达峰值，IFN-β和MX在24小时即显著激活；图G-I的ELISA结果进一步证实感染36小时后TNF-α、IL-6和IFN-β蛋白分泌显著增加。
Figure 4证实了顶向外出型鸭肠道类器官支持NGPV复制。图A为极性翻转示意图；图B显示顶向外出型类器官中ZO-1和Villin定位于外膜；图C和D通过RT-qPCR和TCID50检测表明病毒载量在36小时达到峰值，48小时下降，证实该模型可有效支持病毒感染。
Figure 5展示了NGPV感染顶向外出型类器官后的抗病毒应答。图A-F显示TNF-α和IL-1β mRNA在48小时达峰值，IL-6、IFN-α、IFN-β和MX在36小时显著上调；图G-I的ELISA结果表明感染36小时后TNF-α、IL-6和IFN-β蛋白水平显著升高，提示该模型可诱导强烈的炎症反应和干扰素介导的免疫应答。
原文链接
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41610608/
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