(1)最低抑菌浓度测定与工作浓度确定
研究人员采用微量滴定法测定大麦芽碱和3-苯基-1-丙胺对5株蜡样芽孢杆菌的最低抑菌浓度(MIC)。结果显示,两种群体感应抑制剂对蜡样芽孢杆菌的MIC均为2.5 mg/mL。为确保QSIs不影响细菌正常生长,研究选择了1/8 MIC浓度作为后续基因表达研究的工作浓度。生长曲线分析证实,1/8 MIC浓度下的大麦芽碱和3-苯基-1-丙胺对5株蜡样芽孢杆菌的生长均无显著影响。
(2)群体感应基因表达分析
PlcR-PapR系统:大麦芽碱处理后,plcR基因在菌株A、A9和L中于24小时被完全抑制。在菌株I和C中,由于PlcR-PapR仅在前12小时表达,表达在8小时被抑制,之后不再表达。3-苯基-1-丙胺对除L株外的所有菌株plcR基因均在24小时或更早被完全抑制。
LuxS/AI-2系统:大麦芽碱对luxS基因的抑制作用在不同菌株间差异显著,部分菌株在前24小时未观察到抑制作用。3-苯基-1-丙胺对LuxS/AI-2系统的抑制作用与其对PlcR-PapR系统的作用相似——当系统表达较弱时可完全抑制其表达。
图1 关于群体感应(Quorum Sensing, QS)基因(如 plcR、papR 和 lux)在不同蜡样芽孢杆菌中的表达调控机制
(3)毒力基因表达分析
大麦芽碱处理后,除菌株I在12小时表达nheB基因外,其他菌株在8小时后nheB表达均被完全抑制,部分菌株甚至在4小时就停止表达。对于hblB基因,菌株A在8小时和12小时被完全抑制,菌株C在12小时被完全抑制,菌株L在24小时被完全抑制。clo基因在不同时间点呈现不同程度的上调。3-苯基-1-丙胺处理后,hblB基因在A和A9株中上调,在L株中下调。nheB基因在8小时后被完全抑制。
图2 毒力基因(如 clo, cytK, hblB and nheB)在不同蜡样芽孢杆菌中的表达调控机制
(4)多效性转录调控因子分析
大麦芽碱和3-苯基-1-丙胺处理均显著促进了spo0A基因在大多数研究案例中的表达,这可能增强蜡样芽孢杆菌的孢子形成和生物膜形成能力,从而增加细菌抵抗力,但需要进一步研究证实。大麦芽碱对codY基因的抑制作用与其对luxS基因的抑制作用相似,提示两者作用机制可能存在联系。相比之下,3-苯基-1-丙胺对codY基因没有显著抑制作用。
图3 转录调控因子(如spo0A和codY)在不同蜡样芽孢杆菌中的表达调控机制
(5)蛋白酶基因表达分析
clpP和nprB基因的表达变化高度同步,唯一例外是菌株C在12小时的情况。已知nprB基因编码的蛋白酶能够促进papR的成熟,进而激活转录调控因子plcR来调节clpP。然而,这一关系无法完全解释clpP和nprB基因表达变化之间的高度同步性,提示两者之间可能存在尚未发现的更直接调控关系。大麦芽碱对colA基因的抑制作用几乎与对PlcR-PapR群体感应系统的作用完全相同,提示两者可能通过相同途径被调控。有趣的是,尽管3-苯基-1-丙胺对PlcR-PapR系统的抑制作用与大麦芽碱相似,但对colA基因的调控作用却不同,提示两种化合物虽然对PlcR-PapR系统有相似作用,但可能通过不同途径发挥作用。
图4 蛋白酶基因(如clpP和nprB)在不同蜡样芽孢杆菌中的表达调控机制