2026年1月，河北农业大学袁万哲教授团队在期刊《Veterinary Microbiology》（IF：2.7）在线发表题为：Intestinal organoids screening reveals: 3BDO as an inhibitor of porcine coronaviruses entry by targeting IFITM3 的高水平研究论文。
猪冠状病毒对全球养猪业构成了重大威胁，可导致仔猪严重疾病和高死亡率。尽管实施了各种控制措施，这些病毒仍然阻碍着养猪业的可持续发展。
为了更好地控制猪冠状病毒的流行，我们利用肠道类器官作为药物筛选平台，以识别有效且安全的抗病毒药物。结果显示，3BDO显著抑制肠道类器官单层中的传染性胃肠炎病毒（TGEV）感染，其50%抑制浓度（IC₅₀）为14.6 µM，选择性指数高（SI = 87.67）。
进一步分析表明，3BDO抑制TGEV的内化，这与其增强干扰素诱导跨膜蛋白3（IFITM3）蛋白丰度的能力有关，而IFITM3是已知的抑制病毒与细胞膜融合的蛋白。与此一致的是，敲低IFITM3消除了3BDO的抗病毒活性。此外，3BDO还通过相同机制抑制猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪呼吸道冠状病毒（PRCV）的进入。
总体而言，本研究将3BDO确定为预防和控制猪冠状病毒感染的有前景的抗病毒候选药物。
1. 首次利用猪肠道类器官作为药物筛选平台，克服了传统Vero细胞无法模拟体内生理环境的局限性，为猪冠状病毒抗病毒药物研发提供了更接近生理状态的筛选模型。
2. 从40种化合物中筛选出3BDO作为高效抗TGEV候选药物，IC50为14.6μM，选择性指数高达87.67，兼具高效性与安全性。
3. 阐明3BDO通过激活mTOR通路而非抑制自噬发挥抗病毒作用，明确了其分子机制，解决了该药物作用靶点的争议。
4. 发现3BDO特异性增强IFITM3蛋白表达而非转录水平上调，通过稳定IFITM3蛋白阻断病毒入侵，揭示了mTOR-IFITM3轴在冠状病毒入侵调控中的新机制。
5. 证实3BDO对PEDV、PRCV和PDCoV等多种猪冠状病毒均具有广谱抑制活性，为猪冠状病毒病的综合防控提供了潜在广谱抗病毒策略。
猪冠状病毒（包括TGEV、PEDV、PRCV等）是全球养猪业的重要病原，主要感染小肠上皮细胞，引起仔猪严重腹泻、呕吐、脱水等症状，具有高发病率和高死亡率特征，造成巨大经济损失。尽管已实施多种防控措施，这些病毒仍持续威胁养猪业的可持续发展。
抗病毒化合物在控制猪冠状病毒感染中发挥关键作用，但目前尚未有有效抗病毒药物进入临床应用。现有研究主要依赖Vero等非生理性细胞系进行高通量药物筛选，无法准确模拟体内感染环境，这是制约抗猪冠状病毒药物研发的主要瓶颈。
肠道类器官技术自2009年建立以来，能够模拟肠道微环境并长期稳定传代，包含干细胞、杯状细胞、潘氏细胞、肠上皮细胞等多种细胞类型。研究团队前期已成功建立顶端朝外的肠道类器官模型，证实TGEV可通过RIG-I/NF-κB/HIF-1α/糖酵解轴诱导炎症反应，与动物实验结果一致，证明该模型能忠实模拟体内感染环境，是理想的抗病毒药物筛选平台。人肠道类器官已用于筛选抗诺如病毒、SARS-CoV-2和轮状病毒药物，但动物肠道类器官在抗病毒药物筛选中的应用尚待开发。
1. 肠道类器官单层的建立：从健康猪空肠分离隐窝，经EDTA处理和机械刮取获得隐窝悬液，Matrigel包埋培养5天后，TrypLE消化为单细胞或小片段，接种于48孔板（含1.5% Matrigel）培养3天形成单层。
2. 药物筛选与毒性评估：40种化合物（20μM）预处理类器官单层1h后感染TGEV，再次给药处理18h，RT-qPCR检测抑制率；CCK-8法测定CC50，计算选择性指数SI。
3. 病毒感染与复制周期分析：在ST细胞和类器官单层中分别进行病毒灭活、吸附、入侵、复制和释放实验，通过RT-qPCR、TCID50、Western blot和免疫荧光确定3BDO作用环节。
4. 机制研究：利用PIK3C3敲除ST细胞区分自噬与mTOR通路；雷帕霉素处理验证mTOR依赖性；Western blot和RT-qPCR检测IFITM1/2/3蛋白及mRNA水平；siRNA敲低和Myc-IFITM3过表达验证IFITM3功能。
5. 广谱性验证：在ST细胞和PK-15细胞中检测3BDO对PRCV和PEDV的抑制效果。
Figure 1：展示利用猪肠道类器官筛选抗TGEV化合物的实验流程。图A为技术路线图，包括肠道类器官分离培养、药物筛选、RT-qPCR检测和细胞毒性评估；图B显示40种化合物中3BDO对TGEV抑制率超过90%，显著优于其他药物，并展示其化学结构；图C显示3BDO在肠道类器官中的CC50为1280μM，IC50为14.6μM，选择性指数SI为87.67，表明其具有良好的安全性和抗病毒活性。
Figure 2：验证3BDO对TGEV感染的抑制作用。图A-C显示在肠道类器官单层中，3BDO以剂量依赖性方式抑制TGEV感染，Western blot显示病毒N蛋白减少，TCID50测定病毒滴度降低，免疫荧光显示病毒信号减弱；图D-F显示在ST细胞中，3BDO同样表现出显著的抗病毒效果，RT-qPCR、Western blot和TCID50结果均证实病毒RNA水平、蛋白表达和病毒滴度显著下降。
Figure 3：确定3BDO在病毒复制周期中的作用环节。通过设计病毒灭活、吸附、入侵、复制和释放五个阶段的实验，图A显示3BDO不能直接灭活病毒；图B显示不影响病毒吸附；图C显示在ST细胞和类器官中均显著抑制病毒入侵；图D和E显示对病毒复制和释放无显著影响，表明3BDO特异性靶向病毒入侵阶段。
Figure 4：阐明3BDO抗病毒作用的分子机制。图A-B显示在PIK3C3敲除的ST细胞中，3BDO仍能有效抑制TGEV，证明其作用不依赖于自噬；图C-E显示雷帕霉素（mTOR抑制剂）可完全消除3BDO的抗病毒效果，在ST细胞和类器官中均得到验证，表明3BDO通过激活mTOR通路发挥抗病毒作用。
Figure 5：揭示3BDO通过IFITM3抑制病毒入侵的机制。图A显示3BDO处理显著增加IFITM3蛋白水平，但不影响IFITM1和IFITM2；图B显示3BDO不影响IFITM3 mRNA水平，提示为转录后调控；图C-D显示过表达Myc-IFITM3可模拟3BDO的抗病毒效果；图E-F显示siRNA敲低IFITM3后，3BDO失去抗病毒活性，证实IFITM3是3BDO发挥作用的必需靶点。
Figure 6：验证3BDO对多种猪冠状病毒的广谱抑制活性。图A-B显示3BDO处理可上调IFITM3蛋白并抑制PRCV和PEDV的N蛋白表达；图C显示敲低IFITM3可消除3BDO对PRCV的抑制效果；图D显示敲低IFITM3同样消除3BDO对PEDV的抑制作用，证明3BDO通过相同机制广谱抑制多种猪冠状病毒入侵。
原文链接
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41712999/
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