本硕博毕业于四川农业大学,四川农大青年教师以第一作者和通讯作者在1区Top期刊发表研究成果

近日，四川农业大学傅竞也/王强研究团队在Plant Biotechnology Journal期刊发表题为“ZmWRKY29 Transcriptionally Represses ZmRBOHC to Attenuate ROS Production and Facilitates Gibberella Stalk Rot Susceptibility in Maize”的研究论文。四川农业大学傅竞也讲师与已毕业硕士研究生朱丽为该论文的共同第一作者，傅竞也讲师与王强教授为该论文的共同通讯作者。

为了探究ZmWRKY29在玉米与禾谷镰孢菌互作中的功能，研究人员创制了该基因的两个独立过表达系（#59, #83），ZmWRKY29在过表达系中的表达水平显著高于野生型。对玉米幼苗茎部接种禾谷镰孢菌菌丝4天后，过表达株系的病斑长度较野生型显著增加，相对真菌生物量也大幅升高。根系也是禾谷镰孢菌侵染宿主的重要部位，在对根系进行抗病性鉴定后发现，过表达ZmWRKY29同样增加了根系发病程度，真菌生物量也显著升高。进一步对成熟的玉米茎部接种禾谷镰孢菌孢子，7天后观察发现，过表达株茎内褐色腐烂病斑长度显著长于野生型。

为探究ZmWRKY29是否影响禾谷镰孢菌侵染下的ROS生成，研究人员首先对受侵染茎秆进行DAB染色，结果显示与野生型（WT）相比，ZmWRKY29过表达株系的红棕色更浅、菌丝更多，说明其ROS积累更少，真菌入侵与增殖更为严重。H₂O₂含量检测进一步证实，ZmWRKY29过表达株系的ROS的含量较野生型更低。此外，几丁质诱导的ROS爆发也在ZmWRKY29过表达株系中显著减弱。胼胝质沉积也是植物响应生物胁迫的重要特征。野生型受侵染茎秆的胼胝质沉积显著高于ZmWRKY29过表达株系。

为了进一步验证ZmWRKY29在GSR抗性中的功能，研究人员在ChinaMu突变体库中获得了ZmWRKY29的Mu转座子插入突变体。苗期茎秆接种结果显示，Zmwrky29-mu对GSR抗性显著增强，病斑长度与病原菌生物量显著降低；成熟期田间接种结果同样发现Zmwrky29-mu突变体病斑长度显著短于野生型。除此之外，Zmwrky29-mu中几丁质诱导的ROS爆发强度也显著高于野生型；DAB染色显示突变体产生更多棕褐色沉淀；H2O2含量检测进一步证实Zmwrky29-mu突变中体ROS积累显著增加。

为解析ZmWRKY29调控GSR抗性与ROS产生的机制，该研究对野生型和ZmWRKY29过表达植株在接种0h和24h后进行RNA-seq分析。RBOH是病原菌诱导ROS产生的关键酶，作者在差异表达基因中筛选到ZmRBOHA和ZmRBOHC，二者在过表达材料中的表达较野生型更低。通过双荧光素酶报告系统，作者发现ZmWRKY29可显著抑制ZmRBOHA和ZmRBOHC的启动子活性。WRKY转录因子通常结合靶基因启动子的W‑box元件。作者对启动子进行系列缺失与点突变，结果显示：即使突变ZmRBOHA启动子最后一个W‑box，ZmWRKY29仍能抑制其转录活性，说明ZmWRKY29对ZmRBOHA的调控可能还依赖其他元件获其他因子；而当ZmRBOHC启动子中-128 bp处的W‑box突变后，ZmWRKY29对其抑制作用消失，表明该位点是ZmWRKY29的关键作用位点。

进一步的DAP‑qPCR实验显示，ZmWRKY29可直接结合ZmRBOHA启动子上多个含W‑box的区域；对富集度最高的-468 bp区域进行EMSA实验，证实其在体外可直接结合该片段。烟草叶片中的DLR实验进一步验证了ZmWRKY29对ZmRBOHA启动子的抑制作用。同样，DAP‑qPCR显示ZmRBOHC启动子-128 bp含W‑box的区域被ZmWRKY29显著富集；酵母单杂交（Y1H）与EMSA均证实ZmWRKY29直接结合该位点，烟草DLR实验也验证了这一抑制效果。

为了明确ZmWRKY29靶向抑制的ZmRBOHC是否调控玉米对GSR的抗性，研究人员获得了EMS诱变的zmrbohc突变体，该突变体在1152 bp处发生C/A单碱基替换，导致蛋白在第384位氨基酸出现提前终止。研究人员对幼苗茎部接种禾谷镰孢菌菌丝。结果显示，zmrbohc突变体的发病症状显著加重，病斑面积与长度均显著扩大。同时，在成株期对玉米茎秆进行田间接种也得到了相似结果。除了GSR抗性显著下降外，zmrbohc突变体中几丁质诱导的ROS爆发也明显减弱。以上结果表明，ZmRBOHC是玉米GSR抗性的正调控因子。禾谷镰孢菌可通过招募ZmWRKY29靶向并抑制ZmRBOHC的转录，进而减少ROS产生，最终导致感寄主病。

ZmWRKY29负调控玉米GSR抗性的机制模式图