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中国农业科学院邓乾春研究员团队利用向日葵花粉微凝胶增强钙藻酸盐水凝胶微球用于蛋白谷氨酰胺酶固定化

2026-03-30 05:53:34

蛋白酶固定化常面临活性损失和传质阻力等问题。本研究开发了一种基于向日葵花粉微凝胶（SPMG）和钙藻酸盐水凝胶微球的新型复合凝胶载体，用于固定化蛋白谷氨酰胺酶（PG）。添加 SPMG 显著提高了复合凝胶载体上固定化 PG 的活性，且 SPMG 与海藻酸盐（Alg）的最佳体积比为 2:1。与游离 PG 相比，固定化 PG 的 pH 耐受性、温度耐受性和储存稳定性均显著提升。这些效果可能源于 SPMG 通过与 Alg 形成氢键作用，以及两者与 Ca²⁺的相互作用，改变了载体的微观结构和水分分布，进而调控了固定化 PG 的性能。随后，利用该载体固定化的 PG 对亚麻籽蛋白分离物（FPI）进行脱酰胺改性，以提升其功能特性和风味。在适宜的脱酰胺水平下，固定化 PG 使 FPI 的溶解性、发泡性和乳化性分别提升了近 100%、50% 和 70%，同时显著降低了其苦味。此外，通过 SDS-PAGE、粒径、zeta 电位、微观结构和光谱特征等分析表征了改性 FPI 的分子结构变化，并结合界面流变学探讨了其潜在机制。本研究阐明了 SPMG 的引入对凝胶载体性能的影响，为调控固定化 PG 的性能提供了参考，也为酶固定化技术提供了新视角。

研究背景

植物蛋白因市场占比大、生产过程碳排放低而备受关注，但富含谷氨酰胺基团的特性使其易通过氢键交联发生聚集沉淀，导致溶解性下降，发泡性、乳化性等功能特性受影响，限制了其在食品工业中的实际应用。脱酰胺改性可将蛋白质中的酰胺键转化为羧基，增强分子间排斥力、削弱氢键作用并舒展蛋白构象，从而提升溶解性，相较于随机且安全性低的物理和化学脱酰胺方法，酶法脱酰胺具有安全高效的优势。蛋白谷氨酰胺酶（PG）可特异性催化蛋白质侧链上的谷氨酰胺残基，且不引起蛋白质水解，但游离 PG 易聚集、自脱酰胺，存在活性稳定性低、难以从反应体系中分离等问题，制约了其应用。酶固定化技术虽有望解决上述问题，但固定化载体的组成和结构直接影响固定化酶性能，固定化蛋白酶常因结构变化、空间位阻和扩散限制导致活性损失，因此维持甚至提升蛋白酶活性至关重要。向日葵花粉微凝胶（SPMG）具有刚性外壁与柔软内壁的独特结构，富含纳米和微孔结构及羧基、羟基等功能基团，生物相容性好、安全环保且可生物降解，具备作为酶固定化载体的潜力，但其凝胶强度差导致重复使用性低；而钙藻酸盐凝胶分离性能优良，却因孔径致密存在显著传质阻力。将 SPMG 与海藻酸盐（Alg）结合制备复合凝胶，可兼具多尺度孔隙结构和高凝胶强度，避免单一载体的缺陷。亚麻籽蛋白分离物（FPI）氨基酸组成均衡、功能活性强，但谷氨酰胺残基丰富导致功能特性欠佳，适度可控的脱酰胺改性可提升其功能特性，因此本研究构建 SPMG - 钙藻酸盐复合凝胶载体固定化 PG，探究其对 PG 性能的调控作用，并将其应用于 FPI 的脱酰胺改性，为食品工业酶固定化提供新型载体，同时拓展 FPI 的应用场景。

图文赏析

Fig. 1：新型复合凝胶载体的制备及其固定化蛋白谷氨酰胺酶（PG）的过程示意图（a）及固定化 PG 的性能（b-c）。

Fig. 2：体积比为 0:1、1:2、1:1 和 2:1 的复合凝胶微球的伪彩色图、实物图、冷冻扫描电镜（cryo-SEM）图像（a）及内部水分分布（b-c）。

Fig. 3：不同样品的 X 射线光电子能谱图：（a）向日葵花粉微凝胶（SPMG）、（b）SPMG-CaCl₂、（c）海藻酸盐（Alg）、（d）Alg-CaCl₂、（e）SPMG-Alg-CaCl₂。

Fig. 4：SPMG、SPMG-CaCl₂、Alg、Alg-CaCl₂和 SPMG-Alg-CaCl₂的傅里叶变换红外光谱（FTIR）（a）、X 射线衍射（XRD）图谱（b）、热重分析（TG）图谱（c）及差示热重分析（DTG）图谱（d）。

Fig. 5：1 - 乙基 - 3 - 二甲胺基丙基碳二亚胺（EDC）/N - 羟基丁二酰亚胺（NHS）浓度（a）、激活时间（b）和加酶量（c）对固定化 PG 酶活性的影响（阴影区域为 “误差带”）；固定化 PG 的傅里叶变换红外光谱（FTIR）（d）、热重分析（TG）图谱（e）、差示热重分析（DTG）图谱（f）及激光共聚焦显微镜（CLSM）图像（g-i）。

Fig. 6：固定化 PG 与游离 PG 的最适反应温度（a）、最适反应 pH（b）、酶促反应动力学（c）、重复使用性（d）、温度稳定性（e）、pH 稳定性（f）以及 4℃（g）和 25℃（h）下的储存稳定性。

Fig. 7：脱酰胺处理前后亚麻籽蛋白分离物（FPI）的亚基组成（a）、溶解性（b）、发泡性及泡沫稳定性（c）、乳化性及乳化稳定性（d）、平均粒径（e）和 zeta 电位（f）。

Fig. 8：脱酰胺处理前后亚麻籽蛋白分离物（FPI）的二级结构（a）、红外光谱（b）、紫外光谱（c）、内源荧光光谱（d）、同步荧光光谱（e：Δλ=15 nm，f：Δλ=60 nm）、表面疏水性（g）以及游离巯基 - 二硫键含量（h）。

Fig. 9：亚麻籽蛋白分离物（FPI）的界面张力随时间变化曲线（a-b）及不同振幅扫描下的李萨如曲线图（c）。

Fig. 10：亚麻籽蛋白分离物（FPI）的冷冻扫描电镜（cryo-SEM）图像（a）及油水界面扩散吸附机制示意图（b）。

研究结论

本研究将向日葵花粉微凝胶（SPMG）与钙藻酸盐结合，制备了一种新型复合凝胶载体，并将其用于蛋白谷氨酰胺酶（PG）的固定化，进而利用固定化 PG 对亚麻籽蛋白分离物（FPI）进行改性。SPMG 与海藻酸盐（Alg）之间的氢键作用，以及两者与 Ca²⁺的相互作用，共同改变了载体的微观结构和理化微环境。当 SPMG 与 Alg 的体积比为 2:1 时，PG 的固定化效果最佳。通过优化 EDC/NHS 浓度、激活时间和加酶量三个参数，确定了 PG 固定化的最优条件。与游离 PG 相比，优化后的固定化 PG 在热稳定性、pH 耐受性和储存稳定性方面均显著提升。

由于固定化 PG 具有温和可控的特性，其在提升 FPI 功能特性方面表现优异。对脱酰胺蛋白分子的结构变化分析表明，改性后的 FPI 分子结构变得松散，粒径减小，zeta 电位降低，表面疏水性增强，表面张力降低。这些变化共同促进了蛋白分子在界面的吸附、解折叠和重排，从而改善了其功能特性。此外，改性后的蛋白分子苦味显著降低，咸味明显增强，风味特性得到改善。

因此，本研究基于 SPMG 构建的复合凝胶载体可作为理想的酶固定化载体，固定化 PG 性能优良，能有效提升 FPI 的功能特性，具有重要的应用价值，同时拓宽了 FPI 在食品工业中的潜在应用场景。

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