内蒙古农业大学刘敏教授等:乳源产酶酵母筛选及产酶和酶学特性研究

于敬丹，曹志军，刘敏^*

（内蒙古农业大学职业技术学院，内蒙古 包头 014109）

摘　要：文章从少数民族地区发酵乳制品中筛选产脂肪酶和蛋白酶的酵母菌并进行初步鉴定，对其所产脂肪酶和蛋白酶进行产酶特性和酶学特性研究。结果表明，筛选到产脂肪酶和蛋白酶的酶母菌株JR-21为发酵毕赤酵母（Pichia fermentans）。产酶特性表明，在40 ℃、pH5.0及接种量4%条件下，菌株JR-21所产脂肪酶和蛋白酶活性达到最高；酶学性质表明，菌株JR-21所产脂肪酶和蛋白酶最适水解反应均为40 ℃，在pH6.0条件下，‌酶活力达到峰值；K⁺、Ca²⁺、Na⁺和Mg²⁺均对菌株JR-21所产脂肪酶、蛋白酶具有一定激活效果（P＜0.05），其中Ca²⁺可显著提高菌株JR-21所产脂肪酶和蛋白酶活性（P＜0.05）。本文旨在从乳源样品中筛选可同步产脂肪酶与蛋白酶的酵母菌株，解析其产酶条件与酶学基础特性，为复合酶制剂开发提供优良菌种与理论参考。

关键词：产酶酵母菌；产酶特性；酶学性质；乳源；菌种筛选

中图分类号：TS252.1

文献标识码：A

DOI:10.19827/j.issn1001-2230.2026.06.004

0　引　言

传统发酵乳制品中存在优良的自然菌株，能够提供丰富的菌系和酶系，起到丰富产品功能成分的作用^[1]。其中，酵母菌作为发酵过程中的功能微生物之一，既能生成乙醇，还可代谢生成醛、酸、酯、酚、酮等骨架香气成分^[2-4]，这些物质对发酵乳制品的风味品质起着关键作用。

目前，一些酵母菌作为辅助发酵剂被应用在奶酪成熟过程中，如马克斯克鲁维酵母（K. marxianus）、乳酸克鲁维酵母（kluyveromyces lactis）、发酵毕赤酵母（pichia fermentans）、汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）等^[5]。马克斯克鲁维酵母和乳酸克鲁维酵母具有较强的乳糖发酵能力，广泛应用于奶制品中^[6]。此外，PADILLA^[7]等对汉逊德巴利酵母、乳酸克鲁维酵母和马克斯克鲁维酵母对传统的山羊乳干酪特征风味的影响开展研究，结果表明，模拟奶酪的条件下，马克斯克鲁维酵母主要产酸类、癸酸乙酯、1-丙醇和苯甲醛。乳酸克鲁维酵母可明显提高酮类、乙酸乙酯和仲醇含量，这些优势产酶酵母菌可用于奶酪的加工中起到增加风味的作用。SØRENSEN^[8]等在奶酪的制作过程中，接种解脂耶罗威亚酵母（Y. lipolytica）、酿酒酵母（S. cerevisiae）和汉逊德巴利酵母以提高其风味品质，与对照组相比，解脂耶罗威亚酵母主要产硫化物、呋喃和短链酮类，汉逊德巴利酵母可明显提高支链醛类和醇类化合物的含量。解脂耶罗威亚酵母、白圆霉（G. candidum）和酿酒酵母具有产脂肪酶和蛋白酶等能力，和干酪风味也有着密切关系^[9]。因此，在干酪成熟过程中，通过强化这些具有产酶优势的酵母菌对风味的形成具有重要作用。近年来，对发酵乳微生物研究偏向于优势产酸细菌的筛选及微生物菌群结构的解析，而对乳源优势产酶酵母菌的研究相对较少。因此，从发酵乳中筛选产酶酵母菌及特性研究对改善乳制品（奶酪）品质和产量提升具有重要意义。

本文为有效改善发酵乳制品（奶酪）风味品质问题，从少数民族发酵乳制品（酸奶、马奶酒、干酪等）中分离筛选高产酶（脂肪酶和蛋白酶）酵母菌，并对其进行16S rDNA测序鉴定，‌分析其产酶特性及酶学特性，为产酶酵母菌菌株的研究开发和利用提供理论依据。

1　材料与方法

1.1　材料与试剂

采集少数民族发酵乳制品（酸奶、马奶酒、干酪等），低温环境下送至实验室。

棕榈酸对硝基苯酯（4-nitrophenyl palmitate，p-NPP）、L-酪氨酸，上海易恩化学技术有限公司；曲拉通，北京索莱宝科技有限公司；三氯乙酸，上海麦克林生化有限公司；三丁酸甘油酯，上海源叶生物科技有限公司；三羟甲基氨基甲烷（Tris(hydroxymethyl)aminomethane，Tris）、北京索莱宝科技有限公司。

1.2　仪器与设备

722G可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；XJ220A SCS电子天平，上海天美天平仪器有限公司；KG-SX-700立式高压蒸汽灭菌锅，日本Tomy Digital Biology公司；HWS-250B恒温恒湿箱，北京恒诺利兴科技有限公司；ZHTY-50V振荡培养箱，上海知楚仪器有限公司；台式高速离心机，湖南赫西仪器装备有限公司。

1.3　试验方法

1.3.1　培养基配制

脂肪酶富集培养基：无水葡萄糖10 g/L、蛋白胨5 g/L、酵母粉3 g/L、麦芽粉3 g/L。脂肪酶发酵培养基：玉米干粉42 g/L、三水磷酸氢二钾7 g/L、无水葡萄糖15 g/L、三丁酸甘油酯5 g/L，吐温80 1.5 g/L。蛋白酶富集培养基：牛肉膏3.0 g/L、琼脂粉20.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L。蛋白酶发酵培养基：蛋白胨10.0 g/L、氯化钠5.0 g/L、蔗糖10.0 g/L。

1.3.2　菌株筛选

产脂肪酶菌株初筛：分别挑取酵母菌单菌落接入YPD液体培养基中，采用梯度稀释法，将1 mL菌悬液稀释至10-7，以10倍梯度，选择10^-4~10^-6稀释梯度的样液，分吸取200 μL涂布于脂肪酶平板筛选培养基上，28 ℃培养2~3 d。筛选透明圈较大的菌种进行产脂肪酶酵母菌复筛。

产蛋白酶菌株初筛：倒置蛋白酶平板筛选培养基，28 ℃培养2~3 d，观察各菌株形态，并测量各菌株在培养皿中产生的水解圈直径。通过测量水解或沉淀区计算所选酵母的细胞外蛋白水解和脂解活性^[10]，记录各菌株数据及菌株编号。筛选透明圈较大的菌种进行产酶酵母菌复筛。

产酶酵母菌复筛：将脂肪酶和蛋白酶的粗酶液分别进行酶活力测定，选择活力最高的菌株。

1.3.3　脂肪酶和蛋白酶酶活力测定

粗酶液制备：挑取单菌落接入富集培养基中，28 ℃、180 r/min条件下，培养24~48 h。将10%种子液接种于发酵培养基，28 ℃、180 r/min条件下培养24~48 h，10 000 r/min离心15 min，取出上清液即为粗酶液。

脂肪酶酶活测定：采用pNP法测定脂肪酶活力^[11]。

蛋白酶酶活测定：采用福林酚法测定蛋白酶活力。参考曹慧等^[12]方法并稍作调整。

1.3.4　菌株鉴定

形态学鉴定和生理生化特性鉴定：形态学鉴定包括对菌株进行美兰染色并观察菌落形状、颜色、表面、边缘特征；生理生化特性的鉴定包括碳源同化实验、糖发酵实验、氮源同化实验等^[13-14]。

分子生物学鉴定：将筛选的目的菌株选用通用引物扩增ITS并测序。将获得的DNA序列在美国国立生物技术信息中心开发的（NCBI）网站上基于局部序列比对算法大致确实菌株种属，使用MEGA 11.0软件构建基因发育树，并通过邻接法构建系统发育树。

1.3.5　酶母菌产酶特性研究

（1）温度对酶活的影响。将温度分别控制在10、20、30、40、50、60 ℃下培养48 h，8 000 r/min，离心10 min，弃沉淀，取上清液测定脂肪酶和蛋白酶活力。

（2）初始pH值对菌株产酶的影响。将初始pH值分别调节为4、5、6、7、8置于28 ℃、180 r/min条件下培养48 h，8 000 r/min，离心10 min，测定脂肪酶和蛋白酶活力。

（3）接种量对酶活的影响。将菌液按体积分数1%、2%、3%、4%、5%接种量在最适温度和pH条件下，180 r/min培养48 h，8 000 r/min，离心10 min、测定脂肪酶和蛋白酶活力。

1.3.6　酶学（脂肪酶和蛋白酶）性质分析

（1）反应温度对酶活性影响。反应温度设定为10、20、30、40、50、60 ℃，‌计算不同温度条件下脂肪酶和蛋白酶的相对酶活力。

（2）反应pH值对酶活性影响。测定反应pH值为4、4.5、5、5.5、6时的酶活，计算脂肪酶和蛋白酶的相对酶活力。

（3）金属离子对酶活性影响：将浓度为10 mmol/L的K⁺、Ca²⁺、Na⁺和Mg²⁺加入粗酶液中，分别计算脂肪酶和蛋白酶的相对酶活力。

1.4　数据处理

每组进行3次平行实验，结果以“平均值±标准差”表示。采用Microsoft Excel 2017和Origin Pro2021软件进行数据分析。

2　结果与分析

2.1　产酶酵母菌的筛选

将少数民族地区发酵乳制品中分离筛选的62 株酵母菌，采用水解圈法进行初筛，其中代表菌株产生的脂肪酶、蛋白酶水解圈形态见图1。由图1(a)和图1（b）可见，产酶菌株均产生了清晰可见、体积较大的透明圈。

图1　代表菌株产脂肪酶、蛋白酶水解圈形态

分别测量记录62株供试菌株透明圈直径，筛选出9株HE值较大的菌株JR-6、JR-12、JR-16、JR-21、JR-22、JR-26、JR-42、JR-53和JR-55进行复筛。

通过透明圈直径大小和酶活力确定9株菌株为较优菌株。由表1可见，菌株JR-21产脂肪酶和蛋白酶透明圈直径分别为10.2 mm、8.3 mm，活力分别为28.20、32.29U/mL，均为最优。因此，确定菌株JR-21为本试验筛选的目的菌株。

表1　菌株脂肪酶、蛋白酶活力及其透明圈直径对照

2.2　菌株形态学鉴定

将菌株JR-21在营养琼脂培养基上28 ℃培养24 h，经美兰染色后的细胞形态见图2（a）。菌落形态呈乳白色圆形，表面光滑、边缘整齐，见图2（b）。

图2　菌株JR-21染色结果及菌落形态

2.3　菌株生理生化特性鉴定

依据《酵母菌的特征与鉴定手册》对菌株进行鉴定与发酵特性分析^[15-17]。结果表明，菌株JR-21具有发酵葡萄糖、半乳糖和蔗糖的能力，但不具备发酵乳糖和麦芽糖的能力，见表2。

表2　菌株JR-21生理生化鉴定

2.4　分子生物学鉴定

采用16S rDNA测序对菌株JR-21进行鉴定，‌选择合适的数据库和比对参数进行序列比对，‌查找同源性‌97%以上‌且最高的物种，构建菌株JR-21系统发育树。由图3可见，菌株JR-21与Pichia fermentans（ML394169）聚类在同一末端分支，该分支自展支持值为100，分支上方一级节点自展支持值为99，聚类结果可信度极高；二者序列相似度达98.55%，进化亲缘关系最近。因此，菌株JR-21被鉴定为发酵毕赤酵母（Pichia fermentans）。

图3　菌株JR-21系统发育树

2.5　酶母菌产酶特性研究

2.5.1　培养基初始培养温度对产酶活力的影响

温度是微生物生长过程中最重要的影响因素之一，温度会影响产酶活力的发挥。由图4可见，不同培养温度下脂肪酶和蛋白酶活力不同，10 ℃时2种酶的酶活力基本一致，约为15 U/mL，无统计学差异（P＞0.05）；在10~40 ℃范围内，脂肪酶的酶活力在20 ℃时显著增大（P＜0.05），而蛋白酶的酶活力的增大相对不显著，随后蛋白酶的酶活力显著增大，脂肪酶酶活力缓慢增大，40 ℃时二者酶活力达峰值，且蛋白酶酶活力显著大于脂肪酶酶活力（P＜0.05）；在40~60 ℃范围内，脂肪酶和蛋白酶酶活力均逐步下降（P＜0.05），蛋白酶酶活力下降速度相对较快，60 ℃时蛋白酶活力虽仍大于脂肪酶酶活力，但显著程度较其他温度下有所下降（P＜0.05）。菌株JR-21产酶受温度影响变化与乔传丽等^[18]研究结果相似。

图4　培养基初始温度对菌株产脂肪酶和蛋白酶活力的影响

2.5.2　培养基初始pH对产酶活力的影响

在最适温度下，发酵液初始pH对菌株JR-21产酶的影响见图5，JR-21产脂肪酶和蛋白酶能力随发酵液初始pH增加均呈先升后降趋势，且菌株JR-21产脂肪酶、蛋白酶最适初始pH为5.0左右（P＜0.05）。pH在5.0和6.0时2种酶酶活力差异最显著（P<0.001），pH高于5.0后，脂肪酶和蛋白酶酶活性均呈下降趋势但仍有较高酶活力（P＜0.05）。试验表明，所筛菌株产酶能力在偏酸性条件下更好。

图5　培养基初始pH对菌株产脂肪酶和蛋白酶活力的影响

2.5.3　不同接种量对产酶活力的影响

接种量不足，微生物发酵过程中不能产生足够菌体量，延长发酵时间。反之则出现微生物生长迅速、产生代谢物过多、氧气不足等问题，不利于产酶^[19]。由图6可见，不同接种量对酶活力具有显著影响（P＜0.05）。脂肪酶和蛋白酶的酶活力随接种量增加而增加，并在接种量达到3%时出现显著差异（P<0.05），当接种量为4%时脂肪酶和蛋白酶酶活力差异最显著（P<0.01），并且均达到峰值，脂肪酶的酶活力显著高于蛋白酶。随后，酶活力随接种量的增加而减小，且脂肪酶的酶活力下降较快。研究表明，随着接种量的增加、菌体增多，需要更充足的营养供应，导致发酵液中营养物质匮乏、氧含量骤减，菌株产酶能力降低。吴子君等^[20]关于产脂肪酶菌株的筛选、鉴定及产酶条件优化的研究表明，接种量3%时达到最佳产酶量。与本研究结果相似。

图6　不同接种量对脂肪酶、蛋白酶活力的影响

2.6　脂肪酶和蛋白酶酶学特性研究结果

2.6.1　反应温度对脂肪酶和蛋白酶催化活性的影响

菌株提取的粗酶液在不同温度下酶活力的大小不同。由图7可见，反应温度在40 ℃左右时，脂肪酶和蛋白酶酶活力达到最高（P＜0.05）。由此表明，菌株JR-21所产脂肪酶为中温脂肪酶。随反应温度增加，脂肪酶和蛋白酶的相对酶活力呈先增后减趋势。在增大阶段，脂肪酶和蛋白酶的相对酶活力增加速率基本一致，均未体现出统计学差异；在下降阶段，脂肪酶的相对酶活力下降速率较低，并在60 ℃时其相对酶活力显著高于蛋白酶（P<0.001）。相关研究表明，最适反应温度在60 ℃以上的蛋白酶被称为嗜热蛋白酶^[21]，最适反应温度在40 ℃以下的蛋白酶被称为嗜冷蛋白酶^[22]。在10~40 ℃反应温度范围内，蛋白酶反应活性随着反应温度的升高而升高，在40 ℃时达到最高；在40~50℃时，酶催化活性迅速降低；在50~60 ℃时，酶催化活性下降趋于平缓。结果表明，菌株JR-21所产蛋白酶为嗜冷蛋白酶。

图7　反应温度对菌株产脂肪酶和蛋白酶活性的影响

2.6.2　反应pH对脂肪酶和蛋白酶催化活性的影响

pH通过影响脂肪酶与底物的解离状态，进而影响酶对底物分子的结合能力及催化能力^[23]。蛋白酶根据其作用的最适pH划分，可分为3类：碱性蛋白酶、中性蛋白酶和酸性蛋白酶，最适作用pH分别为9~11、6.0~7.5和2.0~4.0^[24]。反应pH对菌株JR-21产脂肪酶和蛋白酶活性的影响见图8。当pH为6.0时，酶活力达到峰值且显著高于其他接种量（P＜0.05），当pH小于6.0时，脂肪酶的相对酶活力显著高于蛋白酶（P<0.001），相对酶活力随pH的增加不断增大；当pH为4.0~5.5时，2种酶的相对酶活力增速基本一致；当pH为5.5~6.0时，蛋白酶的相对酶活力快速增大；当pH为6.0时，脂肪酶和蛋白酶的相对酶活力基本一致。在商业应用中，通常使用的真菌源脂肪酶多数为碱性脂肪酶。因此，偏酸性蛋白酶菌株JR-21在后续研究中有待开发利用。

图8　反应对菌株产脂肪酶和蛋白酶活性的影响

2.6.3　金属离子对脂肪酶和蛋白酶催化活性的影响

金属离子是影响酶催化活性的重要因素。乳制品中富含K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Na⁺，在乳品加工过程中，由于生产加工的原因，会有一些金属离子掺入其中，且产出原料乳的动物也会因环境温度、食物、机体状况受到影响。

由图9可见，脂肪酶和蛋白酶在不同金属离子种类影响下，相对酶活力表现不同。K⁺条件下，脂肪酶和蛋白酶酶活力未表现出统计学差异，与对照组情况一致；K⁺、Ca²⁺条件下，脂肪酶和蛋白酶相对酶活力与其他条件下相对酶活力均存在统计学差异（P＜0.05）；Na⁺和Mg²⁺条件下，脂肪酶和蛋白酶相对酶活力无统计学差异。相对对照组而言，各金属离子条件下脂肪酶和蛋白酶的相对酶活力均有所提升，Na⁺和Mg²⁺对2种酶酶活力提升程度相似，K⁺对酶活力影响最小。K⁺金属离子可通过与酶的二硫键作用改变酶的结构，或与底物形成盐从而影响酶的催化性能^[25]］。其中，Ca²⁺对脂肪酶、蛋白酶活力的促进作用最强且显著高于其他组（P＜0.05）。张传丽^[26]研究也证明，当有Ca²⁺存在时，蛋白酶活性达到较高，且Ca²⁺离子被认为是脂肪酶生成的活化剂^[27]。

图9　金属离子对菌株产脂肪酶和蛋白酶活性的影响

3　讨　论

蛋白酶和脂肪酶的活性和分泌量高度依赖环境温度，选取10~60℃做为培养基初始培养温度，覆盖了多种乳制品生产的相关温度范围，可以了解酵母菌在接近冷藏温度和临界失活高温下的产酶情况。本文中蛋白酶和脂肪酶的酶活力均在40 ℃时达到峰值，可应用于多种乳制品工艺生产中。pH值通过直接或间接途径显著影响酵母菌产酶活力，因酶结构和功能依赖于特定pH环境，过高或过低的pH均可能导致酶变性失活。酵母菌通常在pH4.0~6.0范围内生长最佳，此范围菌体代谢活跃，生物量积累较快，间接影响酶的合成。本试验筛选到的菌株的产酶能力在偏酸性条件下更好，在一些乳制品生产中，乳酸菌发酵剂的添加引发初始pH下降，切割-加热阶段，伴随乳酸菌持续产酸及乳清析出导致的二次pH降低，而本试验筛选到的菌株仍能维持较高的产酶活力，具有一定的应用潜力和价值。

本试验中，反应温度在40 ℃时脂肪酶和蛋白酶的酶活力达到最高（P＜0.05）。在乳制品加工中，如切达干酪生产的发酵、凝乳和切割排乳清阶段可适当增高温度来提高脂肪酶和蛋白酶的催化活性。

4　结　论

本文成功从乳制品源中分离并筛选到1株能够同时产生脂肪酶和蛋白酶的菌株JR-21，并鉴定为发酵毕赤酵母（Pichia fermentans）。本文对菌株JR-21进行了产酶条件的优化及酶学特性的研究。结果表明，在温度为40 ℃、pH为5.0及接种量为4%条件下，其所产脂肪酶和蛋白酶活性达到最高，可在酶催化反应最容易达到的反应条件范围内将脂肪、蛋白质等大分子糖类物质水解成小分子脂肪酸、小分子氨基酸或多肽等，因此菌株JR-21在奶酪和马奶酒发酵中具有潜在的应用价值。脂肪酶和蛋白酶最适水解反应温度均为40 ℃，在pH为6.0条件下，‌酶活力达到峰值；K⁺、Ca²⁺、Na⁺和Mg²⁺对菌株JR-21所产脂肪酶、蛋白酶均具有一定的激活作用，其中Ca2+可显著提高菌株JR-21的脂肪酶、蛋白酶的催化活性（P＜0.05）。

综上所述，菌株JR-21发酵产物具有较高的脂肪酶和蛋白酶活性，后续有望通过传统育种或基因工程育种等手段进一步优化其所产脂肪酶和蛋白酶的性能。

（参考文献略）

编辑：王   菲

         马   艳

校对：王   鑫

审核：姜　爽