PBJ | 云南农业大学水稻研究团队揭示OsWRKY15-OsSUT3调控模块增强水稻花粉育性的分子机制

1. OsSUT3是调控水稻花粉育性和结实率的关键基因

研究团队首先扩大了此前构建的F2定位群体进行精细定位，将目的基因锁定到10号染色体的141-kb区间内。通过对该区间内候选基因的测序分析，发现蔗糖转运基因OsSUT3在sfp10中存在一个267 bp的插入/缺失变异，导致移码突变和提前终止，使其编码的蛋白丧失关键的跨膜结构域而功能失活。

为验证OsSUT3是否导致了sfp10的半不育表型，进一步构建了CRISPR/Cas9敲除系KO、过表达系OE和互补系Com。表型分析显示，各材料在株高、分蘖等营养生长性状上无显著差异（图1a），但生殖发育相关性状差异显著。。在花粉发育第12期，OsSUT3缺陷系（sfp10和KO）的花药明显更苍白、皱缩（图1b），花粉育性分别降至64.91%和61.74%，而93-11为95.49%（图1c，f）；花粉管萌发率分别降至11.36%和10.01%，而93-11为52.26%（图1d，g）；主穗粒数减少约23%—26%（图1e，h），结实率降低约46%—49%（图1i）。相反，过表达系和互补系的花药形态、花粉育性及产量性状均完全恢复至正常水平（图1b-k）。这些结果表明，OsSUT3对水稻花粉育性和结实率具有促进作用。

2. OsSUT3促进花粉发育后期淀粉积累

淀粉积累是花粉成熟的重要标志。表达模式分析显示，OsSUT3在花药中优势表达，其转录水平从第10期开始逐渐上升，并在花粉成熟的关键期（第12期）达到峰值。为探究其功能，研究者对第10–12期花药进行了细胞学观察。通过石蜡切片观察发现，在第10期（小孢子液泡化）和第11期（小孢子第一次有丝分裂），花粉均未被染成蓝紫色，淀粉尚未开始积累，形态亦无显著差异；而在第12期，OsSUT3正常表达株系花粉粒染色较深、淀粉积累充分，OsSUT3缺陷株系则出现大量染色弱或不染色的花粉粒（图2a）。扫描电镜和透射电镜观察进一步显示，第12期OsSUT3正常表达株系的花粉粒饱满、形态完整、淀粉等贮藏物质积累充分，而OsSUT3缺陷株系花粉粒明显干瘪、塌陷，淀粉粒等贮藏物质显著减少（图2b）。这些结果表明，OsSUT3对花粉成熟后期贮藏物质、尤其是淀粉沉积至关重要，而充足的淀粉积累是维持花粉育性的重要物质基础。

3. OsSUT3介导花粉发育后期蔗糖向花药运输和碳同化物积累

为揭示OsSUT3在花药发育后期碳水化合物分配中的作用，研究者测定了第12期源叶、库叶、茎和花药中的糖分与淀粉含量。结果显示，在源叶中，各株系的葡萄糖、果糖、蔗糖和淀粉含量无显著差异（图3a）。但在库叶中，OsSUT3缺陷株系的蔗糖含量比OsSUT3完整株系提高了143.72%（图3b）；茎中提高了27.35%（图3c）。而在花药中，缺陷株系的葡萄糖、果糖、蔗糖和淀粉含量分别降低了24.42%、25.88%、53.10%和38.61%（图3d）。

由于静态的糖分测定只能反映某一时刻的积累状态，研究者进一步开展了13CO2脉冲标记示踪实验，以动态追踪光合碳的运输与分配。结果表明，标记后源叶的13C水平在各株系间无显著差异；但在OsSUT3缺陷株系中，库叶和茎的13C含量在标记后2至8小时内持续显著增加，而花药中的13C含量则大幅下降（图3e-h）。这些结果清晰地表明，OsSUT3功能缺失破坏了植株同化物的正常分配，导致蔗糖和同化碳在营养库组织（库叶和茎）中滞留，向花药的运输严重受阻，从而直接限制了花粉成熟期的淀粉合成。

4. OsWRKY15直接结合并激活OsSUT3的表达

为解析OsSUT3的调控机制，研究者对野生型93-11和突变体sfp10第12期花药进行了转录组测序分析，共鉴定出2459个差异表达基因（图4a）。KEGG富集分析显示，“植物-病原互作”和“戊糖与葡萄糖醛酸转化”两条糖代谢相关通路显著富集（图4b）。在差异表达基因中，研究团队发现了10个糖转运蛋白基因，包括7个MST和3个SWEET家族成员（图4c-d）。更重要的是，在富集通路中鉴定出6个转录因子，其中，WRKY家族成员OsWRKY15的转录水平与OsSUT3 的相关性最高（图4e）。进一步时空表达分析显示，OsWRKY15在生殖发育阶段优势表达于穗部，并在花粉发育第12期达到表达峰值，这与OsSUT3的时空表达模式高度一致（图4f）。

启动子序列分析表明，OsSUT3的启动子区存在典型的WRKY转录因子结合元件—W-box基序（图4g）。为了验证二者的互作关系，研究者开展了一系列体内外分子实验。酵母单杂交（Y1H）和凝胶阻滞迁移实验（EMSA）证实，OsWRKY15蛋白能够特异性地直接结合OsSUT3启动子区的W-box元件（图4h-i）。双荧光素酶报告实验（DLR）进一步表明，OsWRKY15能够显著激活OsSUT3的启动子活性（图4j）。此外，染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）结果在体内水平上再次印证了OsWRKY15在OsSUT3启动子区存在显著的富集峰（图4k-l）。这些结果充分证明，OsWRKY15作为上游转录激活因子，直接结合并激活OsSUT3的表达。

5. 遗传学证据揭示OsWRKY15-OsSUT3调控模块控制花粉育性

为了进一步阐明OsWRKY15与OsSUT3之间的遗传关系，研究者利用CRISPR/Cas9技术构建了wrky15敲除突变体，并在该突变背景下分别过表达和敲除OsSUT3，获得了wrky15/OsSUT3-OE和wrky15/OsSUT3-KO材料。

表型分析显示，与野生型相比，wrky15突变体的花药淀粉含量、花粉育性和结实率均显著下降。然而，在wrky15突变背景下过表达OsSUT3，能够显著恢复花药的淀粉积累、花粉育性及结实率；相反，敲除OsSUT3则进一步加剧了上述缺陷（图5a-j）。这一结果提供了坚实的遗传学证据，表明OsSUT3的功能位于OsWRKY15的下游，二者构成一个完整的调控模块，共同控制花粉发育后期的蔗糖转运与淀粉积累。

综上所述，本研究提出了一个清晰的分子调控模型：转录因子OsWRKY15作为转录激活因子，直接结合并上调蔗糖转运基因OsSUT3的表达；OsSUT3则负责将蔗糖从花药质外体运入花粉细胞，为淀粉合成提供碳源（图5k）。这一模块的完整性直接决定了花粉成熟期的淀粉积累水平，进而影响花粉育性和结实率。

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