Plant J | 南京农业大学丁先龙/杨守萍团队揭示大豆耐热育种新模块:GmSPL4a-GmbHLH-GmNAC1调控高温下雄性育性

研究背景

大豆是重要的粮油兼用作物，利用杂种优势是提高大豆产量的重要途径。基于细胞质雄性不育（CMS）系统的三系杂交大豆已在我国实现商业化应用，平均增产接近13%。然而，大豆对环境变化极为敏感，尤其是在开花期遭遇持续高温（High Temperature, HT）胁迫时，常导致花药不能开裂、花粉育性下降，进而造成结实率降低和严重的产量损失。这一耐热性瓶颈极大限制了大豆杂种优势的进一步利用。虽然已知植物中存在复杂的响应高温的分子网络，但针对大豆雄性生殖器官在高温下的育性调控机制，尤其是微RNA（miRNA）与其靶基因如何协同调控该过程，目前仍知之甚少。因此，挖掘关键耐热基因并解析其分子通路，对于培育耐高温大豆新品种具有重要的科学意义和育种价值。

论文概要

南京农业大学国家大豆改良中心的 丁先龙 团队与 杨守萍 团队在 The Plant Journal 发表了题为“The GmSPL4a-GmbHLH-GmNAC1 module regulates male fertility of CMS-based restorer line under HT stress in soybean”的论文，揭示了 由转录因子GmSPL4a、GmbHLH以及负调节因子GmNAC1构成的分子模块，通过调控花药中的活性氧（ROS）稳态和果胶代谢，协同维持大豆恢复系在高温胁迫下的雄性育性。该研究阐明了miR156-SPL4a通路在响应高温信号、维持花粉活性中的核心作用，为大豆耐热分子育种提供了新的理论依据和优异基因资源。

主要研究结果介绍

1. GmSPL4a是miR156b的靶基因且受高温胁迫显著诱导

研究人员通过降解组测序和双荧光素酶报告实验证实，GmSPL4a和GmSPL4b是miR156b的直接靶基因（图1A）。组织表达分析显示，GmSPL4a在大豆花中高度表达。在高温（42/34 °C）处理下，其表达量在处理12小时后较正常温度显著上调22.9倍（图1B）。亚细胞定位和原位杂交实验进一步确认，GmSPL4a蛋白定位于细胞核，且其mRNA主要积累在大豆花药和花粉粒中（图1E, F）。这暗示GmSPL4a可能参与调控高温下的花部发育。

2. GmSPL4a正向调控大豆在高温下的雄性育性

为了验证功能，研究团队利用CRISPR/Cas9技术创制了gmspl4a/4b双敲除突变体，并构建了GmSPL4a过表达（OE）系。在正常温度下，各系育性无明显差异；但在高温胁迫下，与恢复系Williams 82（W82）相比，过表达系维持了更高的花粉活力（62.77%）和萌发率，而突变体表现出明显的花药不开裂和花粉败育，萌发率仅为40%左右（图2D-G）。此外，将过表达系作为父本与CMS不育系杂交，其F1代在高温下表现出更早的结荚和更高的产量。这些遗传学证据表明，GmSPL4a是增强大豆恢复系耐热性的关键因子。

3. GmSPL4a通过清除ROS和维持果胶平衡提高耐热性

高温通常引起花药中活性氧（ROS）的剧烈积累和丙二醛（MDA）含量的升高。研究发现，高温胁迫下，GmSPL4a-OE系花药中的ROS荧光强度显著低于野生型和突变体（图3A, B），且过氧化物酶（POD）活性显著升高（图3E）。同时，果胶代谢也受到该通路的调控。高温会导致果胶非酶促热分解。过表达GmSPL4a显著增强了果胶裂解酶（PL）活性，并维持了更高的总果胶含量，防止了水溶性果胶（WSP）的异常上升（图3F-I）。这说明GmSPL4a通过协同调控抗氧化系统和细胞壁果胶稳态来减轻高温伤害。

4. GmSPL4a与GmbHLH和GmHSP90A1互作共同发挥作用

通过酵母双杂交（Y2H）筛选，研究人员鉴定出GmSPL4a的互作蛋白——转录因子GmbHLH和热激蛋白GmHSP90A1。这些互作在植物体内通过BiFC和Pull-down实验得到了验证（图4）。功能分析显示，GmbHLH的过表达同样能降低高温下花药的ROS水平，提高花粉育性，而其突变体则对高温极度敏感（图5）。这表明GmbHLH作为GmSPL4a的共调节因子，共同参与大豆耐热性的调控。

5. GmSPL4a直接结合并抑制负调节因子GmNAC1的表达

转录组（RNA-seq）分析显示，高温下敲除和过表达GmSPL4a会引起大量基因的差异表达，其中GmNAC1的表达模式与GmSPL4a显著负相关（图7C）。生化实验（Y1H, EMSA, Dual-LUC）证实，GmSPL4a蛋白能直接结合GmNAC1启动子上的GTAC基序并抑制其转录（图7D-F）。进一步的功能验证发现，过表达GmNAC1会降低大豆育性，而敲除GmNAC1则能显著提高植株在高温下的适应能力（图8）。这确立了GmNAC1是该模块中负责介导耐热性受损的负下游靶标。

全文总结与展望

本研究描绘了大豆响应高温胁迫的一条完整调控路径（图9）：在开花期，高温诱导耐热株系中miR156b水平降低，从而释放了对其靶基因GmSPL4a的剪切抑制。积累的GmSPL4a蛋白与GmbHLH及GmHSP90A1形成复合体，该复合体通过直接结合GmNAC1的启动子抑制其表达。这一过程导致花药内POD等抗氧化酶活性增强，清除过量ROS，同时通过调节果胶代谢酶维持了花粉壁的结构完整性，最终保障了高温下花粉的正常发育和萌发。这一发现不仅在理论上拓展了SPL家族在非生物胁迫中的功能内涵，更为利用分子辅助育种和基因编辑技术培育“耐热型”恢复系及其三系杂交豆提供了精准的遗传靶点。

研究团队与资助

该研究的第一作者为南京农业大学的 Hongjie Wang。通讯作者为南京农业大学的 丁先龙和 杨守萍教授。该研究得到了国家自然科学基金（32572395）、国家重点研发计划（2022YFF1003500等）以及江苏省钟山生物育种实验室等项目的资助。

DOI链接https://doi.org/10.1111/tpj.70975