食盐摄入量增加与多种健康问题相关,包括高血压、中风、心血管疾病和胃癌^[1]等。随着全球慢性疾病负担的加剧,减少膳食盐摄入已成为公共卫生领域的核心议题^[2]。目前常用的减盐策略包括隐形减少、咸味增强、多感官应用、物理改性、盐的替代等^[3-5],但是在吞咽之前高达95%的食盐仍然保留在食品基质中,因此解析咸味感知的具体途径,通过调整食品结构促进Na⁺在口腔中释放是有效的减盐方式。

食物中的咸味感知主要包括3个阶段:基质释放、口腔传导和咸味生成^[6]。食品基质中Na⁺的分布状态、结合形式及其在口腔加工中的释放速率,直接影响味觉受体对游离Na⁺的捕获效率^[7]。作为液体食品的典型类型,乳液是一类由两种不混溶液体组成的分散体系。水和油是乳液中最常见的连续相和分散相。NaCl通常添加在水相中,通过定位和控制食品乳液中Na⁺的释放来提高乳液的咸味感知能力。现有研究表明,乳液类型、油/水相组成、乳液稳定性和油水比例都会显著影响Na⁺的释放和感知^[8-10]。

事实上,乳液咸味感知的调节主要通过控制盐浓度和乳液稳定性两种机制实现^[11]。对于O/W乳液,在相同浓度下,乳液的咸味感知远高于不含油滴的水溶液,水相体积分数的减小也会增强咸味感知,这是基于Na⁺浓度浓缩的原理^[12]。对于W/O乳液,Na⁺存在于内相中不与唾液直接接触,Rietberg等^[13]在研究含NaCl的W/O乳液时指出,影响咸味感知的关键因素是口腔加工过程中的乳液失稳。盐浓度、乳化剂浓度与水相体积分数的协同作用可诱导预期的咸味响应。口腔加工过程中乳液的不稳定性可能会导致化合物味觉的变化,这些不稳定过程可能是由聚结、絮凝、乳化等引起的。当水相体积分数较大时,唾液的混合促进了NaCl从内相释放到乳液外部,从而加速了Na⁺转运到味蕾。目前,关于W/O乳液咸味感知的研究主要集中在Na⁺的释放过程上。然而,咸味感知是一个复杂的过程,不仅涉及乳液在口腔加工过程中的破坏和唾液的相互作用,还包括其在舌头表面的滞留以及在黏液层中的扩散,这些因素共同决定了咸味感知的效果。人们对W/O乳液在口腔加工过程中咸味感知的具体机制仍缺乏深入的了解。

油包水高内相乳液(water-in-oil high internal phase emulsions, W/O HIPEs)是一种特殊的乳液体系,其水相体积分数超过74%,具有半固态结构^[14]。与常见的油包水(W/O)乳液不同,W/O HIPEs因高水相体积而展现出独特的物理性质,如更高的黏度和稳定性。这些特性使其在食品应用中具有显著优势,尤其是在调控质构和递送活性物质方面^[15]。此外,W/O HIPEs在模拟口腔加工过程中表现出的动态释放特性,使其成为研究咸味感知和减盐策略的理想模型。本团队前期实验中已经证明,使用聚甘油蓖麻油醇酸酯(polygly-cerol polyricinoleate, PGPR)作为乳化剂,在水相中添加氯化钠(NaCl),通过调节PGPR和NaCl的含量可以制备水相体积分数为80%的W/O HIPEs^[16]。为了进一步探究W/O HIPEs作为黄油脂肪替代物的可行性,达到减脂和减盐的目的,拟在模拟口腔加工的条件下,通过W/O乳液中乳化剂(PGPR)、水相体积分数和NaCl添加量三个因素分析影响口腔中咸味响应的原因,系统分析W/O乳液中Na⁺的含量、游离态和Na⁺的释放对咸味感知的影响。通过体外猪舌实验测定W/O乳液在舌头表面的黏附性;通过Transwell系统测定W/O乳液穿过黏液层到达味蕾的穿透能力;结合电子舌和感官评价,综合分析W/O乳液咸味感知的机制。本研究旨在解析乳液结构参数(乳化剂浓度、盐浓度梯度等)对咸味感知的调控路径,为减盐食品的设计与开发提供理论依据。

1.1 材料与试剂

聚甘油蓖麻油醇酸酯(PGPR),山东优索化工科技有限公司;菜籽油,益海嘉里金龙鱼粮油食品股份有限公司;NaCl荧光素钠、NaHCO₃、KCl、CaCl₂、MgCl₂·6H₂O,上海麦克林生化科技股份有限公司;呢罗红、Type Ⅱ型猪胃黏蛋白(PGM)、α-淀粉酶,美国Sigma-Aldrich公司。实验所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

UltraTurrax, model T25型高速剪切机,德国IKA公司;JJ-1型精密定时电动搅拌器,常州荣华仪器制造有限公司;Zeiss LSM880型倒置共聚焦显微镜,德国Carl Zeiss公司;DDS-307A型电导率仪、DWS-51型钠离子计,上海仪电科学仪器股份有限公司;730系列ICP-OES型电感耦合等离子体发射光谱仪,美国安捷伦科技有限公司;600 MHz AVANCE NEO型宽腔固体核磁共振波谱仪,德国布鲁克仪器公司;HWS-24型电热恒温水浴锅,上海一恒科学仪器有限公司;OCA 25型视频光学接触角测量仪,德国 Dataphysics 公司;Vortex-6型旋涡混合器,海门其林贝尔仪器制造有限公司;BT301F型蠕动泵,保定雷弗流体科技有限公司;SA402B型电子舌,日本Insent公司。

1.3 实验方法

1.3.1 W/O高内相乳液的制备

采用一步乳化法制备W/O HIPEs^[17]。连续相制备:将不同质量分数(4%、6%、8%)的PGPR与菜籽油混合,使用磁力搅拌器在65 ℃下加热溶解,冷却后备用。分散相制备:将不同浓度梯度(10、100、200 mmol/L)的NaCl溶于去离子水中,磁力搅拌至完全溶解。使用高速剪切机制备W/O HIPEs。在5 000 r/min转速下,将体积分数为30%、50%、80%的分散相匀速倒入连续相中,随后在7 000 r/min转速下持续剪切5 min得到W/O 乳液。

不同W/O乳液的命名规则:含有80%水相体积分数、100 mmol/L NaCl,不同PGPR质量分数(4%、6%、8%)的系列乳液依次标记为P-4、P-6、P-8;含有6% PGPR、100 mmol/L NaCl,不同水相体积分数(30%、50%、80%)的系列乳液依次命名为D-30、D-50、D-80;含80%水相体积分数、6% PGPR,不同NaCl浓度(10、100、200 mmol/L)的系列乳液依次命名为Na-10、Na-100、Na-200。

1.3.2 Na⁺含量测定

使用电感耦合等离子体发射光谱仪对W/O乳液中Na⁺的含量进行精确测定,一般测定时样品由载气(氙气)引入雾化系统进行雾化后,以气溶胶形式进入等离子体中心区,在高温和惰性气体中被去溶剂化、汽化解离和电离,转化成带正电荷的正离子。正离子经离子采集系统进入质谱仪,依据质荷比实现离子的分离,根据元素质谱峰强度测定样品中相应元素的含量。W/O乳液在测定前需要进行消解和稀释处理。

1.3.3 游离态Na⁺测定

由于咸味是由游离态的Na⁺引起的,减少结合态Na⁺的量可以增加Na⁺的利用率,从而增强咸味感知。采用钠的核磁共振(²³Na NMR)法测定乳液中钠的自扩散系数。将乳液转移至直径5 mm的核磁管中进行²³Na NMR测定。

1.3.4 Na⁺的静态释放量测定

通过测定电导率变化,评估W/O乳液中的Na⁺在去离子水和人工唾液中的静态释放量。将3 mL乳液置于装有100 mL去离子水或人工唾液的烧杯中。将电导率探针深入液面下监测30 min内电导率的变化,每分钟记录一次数值,记录Na⁺从W/O乳液中的释放过程。实验过程保持37 ℃以模拟口腔温度,同时以500 r/min持续搅拌促进Na⁺的释放。人工模拟唾液依据表1配方配制。

表1 人工模拟唾液配方

Tab.1 Composition of artificial saliva g/L

1.3.5 Na⁺的动态释放量测定

通过测定电导率变化,评估W/O乳液中的Na⁺在去离子水和人工唾液中的动态释放量。取22.5 mL的乳液与7.5 mL的唾液混合,放置于50 mL烧杯中。使用精密定时电动搅拌器模拟口腔的咀嚼,在200 r/min的搅拌速度下搅拌200 s测定电导率的变化,每咀嚼20 s记录一次数值。使用电导率仪记录Na⁺在模拟口腔加工过程中从W/O乳液中的释放过程。按表1配制人工模拟唾液。

1.3.6 W/O乳液在猪舌上的黏附测定

W/O乳液在猪舌上的黏附保留实验参考Cook等^[18]的方法进行。在当地超市购买猪舌,去除血渍后,将猪舌表面切割为长宽厚为2 cm×2 cm×2 mm的小方形,保证每一块基本相同。将0.1 mL的W/O乳液平铺在猪舌的表面,固定在倾斜角为45°的载玻片上。随后,使用蠕动泵控制人工唾液的流速为 1 mL/min。对猪舌表面的乳液进行洗脱,收集洗脱后的唾液-乳液混合物,使用钠离子计测定混合物中Na⁺的含量。为表征乳液在洗脱过程中在猪舌上的宏观和微观分布,使用质量分数为0.1%的荧光素钠和0.1%的尼罗红对W/O乳液中的Na⁺和油相进行染色。使用倒置共聚焦显微镜在10倍的物镜下对乳液的微观结构进行观察。

使用光学接触角测量仪研究不同W/O乳液在猪舌表面的润湿性。首先将乳液与唾液混合降低乳液的黏度,使其可以使用悬滴法进行测量。将猪舌作为基底放置于光学玻璃板上,然后使用高精度的注射器将一滴乳液(5 μL)滴在猪舌表面,拍照记录薄片表面的液滴。根据LaPlace-Young方程拟合液滴轮廓,计算接触角。

1.3.7 Na⁺的穿透性测定

采用Transwell^®系统探究W/O乳液中Na⁺穿过黏蛋白层从供体腔到受体腔室的扩散。扩散小室由聚碳酸酯Snapwell^®制成,将50 μL的人工唾液平铺在供体腔内滤膜的表面,随后在唾液层之上加入0.1 mL的乳液;将1 mL的PBS放置于受体腔内,构建Transwell^®系统。将Transwell^®系统放置于37 ℃的恒温振荡器上进行孵化,每隔2 h从受体腔内取出乳液采用钠离子计测量Na⁺含量。在实验开始后2 h,通过CLSM对滤膜上的乳液和Na⁺残留进行Z层扫描,探究乳液在Transwell^®系统的穿透性。

1.3.8 电子舌分析

电子舌具有广域选择特异性的人工脂膜传感器,可以模拟生物活体的味觉感受机理,通过检测各种味物质和人工脂膜之间的静电作用或疏水性相互作用产生的膜电势的变化,实现对5种基本味(酸、甜、苦、咸、鲜)和涩味的评价。首先,使用去离子水对W/O乳液进行涡旋、剪切稀释,离心过滤后采用电子舌进行味觉评价。电子舌检测条件为:清洗6 min,测试时间30 s,输出先味值;后参比液清洗30 s,传感器插入新的参比液中测试回味30 s,采用食品五味传感器C00、AE1、CA0、CT0、AAE测试4次,去掉第1次循环取后3次平均值作为测试结果。参比溶液为0.3 mmol/L酒石酸和30 mmol/L KCl溶液。

1.3.9 感官评价

为测试W/O乳液咸味感知和油脂风味,邀请了10位志愿者进行感官评价。志愿者年龄在20～30岁,无味觉或嗅觉障碍。实验内容主要为,测试W/O乳液的质地、咸味、油脂的油腻感和润滑感并进行评价。为保证评价结果准确,要求志愿者在实验开始1 h内勿吃刺激性食物或喝饮料。在实验开始前,志愿者首先感知纯净水和100 mmol/L NaCl溶液的咸味强度,漱口后进行感官品评。每个样本准备5 mL放在品评杯中进行评价,并在口中含20 s,然后将样品吐到一次性杯子中。志愿者需要观察样品的质地、气味并打分,并参考100 mmol/L NaCl溶液来判断样品的咸度分数,综合20 s内样品的咸度为样品打分(1～10分)。同时感知样品入口时油脂的风味、油腻感、润滑感并进行评价。志愿者用纯净水彻底漱口2 min进行下一个样品的评价(1分为最弱感知,分数增加感知加强,10分为最强感知)。感官评价标准如表2所示。所有志愿者都签署了知情同意书。

表2 感官评价标准

Tab.2 Sensory evaluation criteria

1.4 数据分析

除特殊注明外,所有实验均进行3次独立重复。使用Origin 2019和SPSS 29软件对实验数据进行统计分析,数据以平均值±标准偏差表示,运用单因素方差分析(One-way ANOVA)结合Duncan多重比较法,以P<0.05为显著性阈值,分析组间差异的统计学意义。

2.1 W/O乳液中Na⁺的结合状态分析

在食物系统中,并非所有的Na⁺都存在于同一环境中,有些Na⁺是游离态(单独存在),而有些Na⁺可以与食品大分子中带负电荷的基团,如蛋白质和碳水化合物中的羧基结合。食物的咸味感知由食品中游离的Na⁺所决定,减少结合Na⁺的量可以增加Na⁺的利用率,从而增强咸味感知。为了系统研究不同盐浓度对乳液结构、Na⁺释放和咸味感知的影响,本研究选择了10、100、200 mmol/L NaCl浓度梯度,以覆盖低盐、中盐、高盐的应用环境。²³Na核磁共振可用于检测Na⁺的迁移率。Na⁺的横向弛豫速率(R², s^-1)可以从单脉冲实验中得到,R²值越高,Na⁺的迁移率越小,这是由于Na⁺在体系中的结合程度更大^[19]。图1展示了不同W/O乳液的²³Na核磁共振谱。²³Na的化学位移通常在[-20, 20]×10^-6,游离Na⁺在水溶液中位移约为0。从图1中可以看出,乳液中Na⁺出现了轻微偏移,Na⁺可能处于类似自由离子的状态,推测是Na⁺与油脂和PGPR发生了短暂相互作用。在生理条件下,油相中所含有的游离脂肪酸会解离为带负电荷的羧酸根离子(—COO^-),这种电荷特性可以与带正电荷的Na⁺相结合,形成结合态的Na⁺。但图1中Na⁺仅发生轻微偏移,证明结合态的Na⁺很少。在一项研究中,明胶中带负电荷的基团较少,意味着能与Na⁺相互作用的位点较少,但通过感官评价发现,蛋白质基质的流变学性质对咸味感知的影响大于Na⁺的流动性^[20]。同样,其他研究也表明,蛋白质中的Na⁺(包括游离Na⁺和结合Na⁺)远低于引起盐度差异所需的阈值^[21]。本实验中制备的W/O乳液具有不同的形态特征。普通W/O乳液(D-30和D-50等)的水相体积分数较低,因此呈现出较为流动的液体形态,质地均匀且黏度较低,易于分散和混合。相比之下,HIPEs(D-80等)的水相体积分数较高,呈现出半固态结构,质地致密且黏度较高,表现出一定的弹性和塑性^[16]。因此在W/O乳液咸味感知的影响因素中,Na⁺的结合状态并不是主要因素,且所有乳液之间的结合程度并无明显区别,在后续分析中可以忽略该因素的影响。对于半固态和液态食品,食品基质的流变学、摩擦学和黏附性对食品咸味感知的影响较大。

图1 不同PGPR浓度、水相体积分数和NaCl 浓度稳定的W/O乳液²³Na核磁谱Fig. 1 ²³Na NMR spectras of W/O emulsions stabilized with different PGPR concentrations, aqueous phase volume fractions, and NaCl concentrations

2.2 W/O乳液中Na⁺的含量分析

为更好地说明W/O乳液中Na⁺的分布与释放,使用电感耦合等离子体发射光谱(ICP-OES)技术测量不同水相体积分数的W/O乳液(包括普通W/O乳液和高内相乳液HIPEs)中Na⁺的含量。ICP-OES是结合了电感耦合等离子体(ICP)的高温电离能力与发射光谱的高灵敏度质量分离技术,可以精确测量乳液中Na⁺的含量,有助于后续Na⁺的释放和在猪舌表面的黏附分析。表3展示了不同W/O乳液中Na⁺的含量。表3结果显示,乳液体系中最终测得的Na⁺含量与初始添加的Na⁺含量存在一定的偏差,这种偏差可能源于乳液制备过程中部分Na⁺的损耗,如在搅拌、剪切等操作中Na⁺可能被带出体系,在乳液的取样、定容和稀释过程中,部分Na⁺可能因吸附或沉淀而损失。

表3 W/O乳液中Na⁺的含量

Tab.3 Content of Na⁺ in W/O emulsions

2.3 W/O乳液中Na⁺的静态释放量分析

在口腔加工过程中,乳液的不稳定性会导致Na⁺从乳液的内部水相中释放,特别是对于W/O和W/O/W乳液,从而增强咸味感^[8]。从内部水相中释放的Na⁺可通过外部水相中的电导率变化来确定,因为覆盖内部水液滴的油层是不导电的,可以消除内部水相中存在的Na⁺对电导率的影响^[22]。图2展示了W/O乳液在去离子水中和模拟唾液中Na⁺的静态释放情况。在以去离子水为分散介质的研究中,W/O乳液中Na⁺存在于水相中,释放主要依靠W/O乳液在去离子水中的分散性。以500 r/min的速率搅拌,确保W/O乳液均匀分散在去离子水中而不黏附在烧杯上。由图2(a1)可知,在P-4和P-6乳液中,Na⁺的释放速率和总释放量显著高于P-8乳液,表明乳化剂的增加形成的致密网络结构会减缓水相中的Na⁺释放到分散介质中^[23]。由图2(b)可知,在以唾液为分散介质的实验中,W/O乳液中Na⁺的释放非常少,可能是由于黏蛋白的乳化作用。在搅拌过程中向唾液中加入少量的W/O乳液,此时W/O乳液会快速分散为多个小的“W/O乳液”液滴。在此过程中,黏蛋白发挥其乳化作用快速吸附在油相-唾液的界面上,形成了稳定的以唾液为连续相、黏蛋白为乳化剂、W/O乳液为分散相液滴的体系,阻止了W/O乳液内部水相Na⁺的释放。由图2(a2)可知,水相体积分数的增加会促进W/O乳液中Na⁺的释放,但其主要原因为水相体积分数为80%的W/O HIPEs乳液中Na⁺质量浓度为1 561.8 mg/kg,但在水相体积分数为30%的W/O乳液中仅为448.3 mg/kg(见表3)。在假设体系中Na⁺含量相同的情况下,D-30中的Na⁺释放含量明显高于D-80乳液,这与之前的结论相反。水相体积分数较低的W/O乳液为流动的液体,在去离子水中更容易分散为多个液滴,促进水相中Na⁺的释放。而D-80 W/O HIPEs呈现半固体状态,其表观黏度远高于D-30乳液,在去离子水中的分散性较差,不利于水相中Na⁺的释放。同样,由图2(b)可知,Na⁺在唾液中的释放也因唾液蛋白的乳化作用减少了水相中Na⁺的释放。由图2(a3)和图2(b3)可知,在探究NaCl浓度对乳液Na⁺释放的实验中,NaCl浓度的增加是导致分散介质中Na⁺含量显著提升的主要因素,但同时Na-10乳液的释放速率高于其他乳液,可能是由于其稳定性较差的原因。

图2 不同PGPR浓度、水相体积分数、NaCl浓度稳定的W/O乳液中Na+在去离子水和唾液中的静态释放情况Fig.2 Static release of Na+ in W/O emulsions stabilized with different PGPR concentrations, aqueous phase volume fractions, and NaCl concentrations in deionized water and saliva

2.4 W/O乳液中Na⁺的动态释放量分析

Na⁺在口腔中的释放受到口腔加工特性的影响,为了进一步分析W/O乳液中Na⁺的释放特性,采用体外模拟口腔加工的方式分析Na⁺的动态释放过程。图3展示了模拟口腔加工过程中乳液在去离子水中和模拟唾液中Na⁺的动态释放。在本实验中,采用不连续取样法,每隔20 s测量Na⁺的释放情况;电动搅拌器模拟口腔咀嚼对乳液和唾液的混合搅拌作用。由图3(a1)可知,在不同PGPR稳定的W/O HIPEs中,在咀嚼初期, W/O乳液结构被破坏,大量Na⁺从乳液中释放出来;随着咀嚼时间的进一步增加,Na⁺的释放速率逐渐减缓。在以去离子水为分散液的实验中,对于P-4乳液,在咀嚼前40 s内,超过50%的Na⁺从乳液中释放出来;相比之下,P-6和P-8乳液在咀嚼初期的Na⁺释放速率较慢。由图3(b1)可知,在以唾液为分散介质的实验中,唾液的存在加速了W/O乳液中Na⁺的释放,在咀嚼初期,Na⁺的释放速率明显加快。在200 s的咀嚼周期结束后,W/O乳液Na⁺在唾液中的总释放量也显著高于在去离子水中的释放。这主要是由于在W/O乳液中,Na⁺存在于内水相中,咸味感知主要依托于W/O乳液在口腔加工过程中的不稳定性^[13]。乳化剂浓度的减小可以加速W/O乳液在口腔中发生不稳定现象,在咀嚼作用下被分解成多个小液滴并发生相反转,有利于水相中Na⁺释放到口腔中被味觉感受器感知,增强乳液的咸味感知。在其他研究中也证实了W/O乳液会在口腔加工过程中发生相反转为O/W乳液,导致其咸味感知和O/W乳液相近^[24]。

图3 不同PGPR浓度、水相体积分数、NaCl浓度稳定的W/O乳液中Na⁺在去离子水和唾液中的动态释放情况Fig.3 Dynamic release of Na⁺ in W/O emulsions stabilized with different PGPR concentrations, aqueous phase volume fractions, and NaCl concentrations in deionized water and saliva

由图3(a2)和图3(b2)可知,在去离子水和唾液的分散液中,D-80 HIPEs中Na⁺的释放量显著高于D-50和D-30乳液,其较大的差异主要源于体系中Na⁺含量的不同。同样,唾液的存在也加速了乳液中Na⁺的释放。本团队前期实验已经证明了,在初始状态下,不同水相体积分数的W/O乳液都具有良好的物理稳定性^[25]。但在与唾液混合后,对于水相体积分数较高的D-80 HIPEs,唾液蛋白乳化能力更强,可以加速乳液结构的破坏,促使水相中Na⁺释放到口腔中增强咸味感知。较高的水相体积分数也意味着在食用过程中乳液中覆盖口腔黏膜的油量较少,有利于咸味感知^[26]。NaCl浓度的增加也会影响W/O乳液中Na⁺的释放。由图3(a3)和图3(b3)可知,不同于静态释放实验的结果,在模拟口腔加工过程中,咀嚼作用会加速唾液对W/O乳液结构的破坏,促进Na⁺在口腔中的释放。在口腔加工过程中,食物的质地会因咀嚼、唾液、剪切、混合和加热或冷却而改变。通过调控乳液的结构促进其在口腔加工过程中结构瓦解和破碎,使得更多的Na⁺释放到口腔中被味觉感受器所感知,有利于增加咸味感知和达到减盐的目的。

将所得的释放数据分别与零级释放动力学模型、一级释放动力学模型进行拟合,分析Na⁺的释放动力学。表4为W/O乳液中的Na⁺在不同分散介质中的释放动力学参数,以各模型的回归系数(R²)作为评价模型优劣的主要指标。W/O乳液的Na⁺在以去离子水为分散介质的静态释放中,零级释放动力学模型R²最大,Na⁺的释放与初始浓度关系较小。在以唾液为分散介质的静态释放中,W/O乳液的Na⁺释放量极低,这主要反映了唾液本身的Na⁺含量,而非乳液中Na⁺的释放行为。唾液蛋白的乳化作用和乳液的稳定性共同限制了Na⁺的释放,导致释放曲线无法体现典型的释放动力学特征,因此未进行模型拟合。在以去离子水为分散介质的动态释放中,一级释放动力学模型R²最大,Na⁺的释放受到W/O乳液中初始浓度的影响,在2.3中已经说明。在以唾液为分散介质的动态释放中,黏蛋白的存在影响较大,拟合系数R²都相对较小,遵循一级释放动力学。

表4 W/O乳液中Na⁺的释放动力学参数

Tab.4 Kinetic parameters of Na⁺ release in W/O emulsions

2.5 W/O乳液中Na⁺在猪舌上的黏附情况分析

2.5.1 PGPR浓度对W/O乳液中Na⁺在猪舌上黏附的影响

在口腔中,食品所黏附的主要位置是上颚和舌头,舌头是一个参与感觉和运动的器官,并传递食品的口感特征^[27]。在口腔的咸味感知中,Na⁺在舌头表面滞留的黏附行为是一个很重要的影响因素^[28]。为表征W/O乳液在舌头表面的黏附性对咸味感知的影响,采取新鲜猪舌作为模型,探究不同条件下W/O乳液在猪舌表面的黏附和残留,并通过激光共聚焦显微镜对猪舌表面残留的乳液和Na⁺进行观察^[29]。图4显示了不同浓度PGPR稳定的W/O HIPEs在体外猪舌上的滞留情况。由图4(a)可见,宏观情况下,随着唾液的不断冲洗,W/O HIPEs在猪舌表面的残留量逐渐减少,在冲洗7 min后,猪舌表面基本不含有乳液的黏附,无明显乳液残留,由图4(b)可见,在微观结构上表现为红色区域(乳液)逐渐变暗、变少[图4(a)]。由于W/O HIPEs为半固态,其黏度较高,在洗脱前2 min,乳液黏附在猪舌表面较难冲洗下来。从第3 min开始,猪舌表面才有大块乳液被洗脱,表现为白色乳液(宏观)和红色区域(微观)的显著减少[图4(b)]。在PGPR质量分数为4%时(P-4),经过5 min的唾液洗脱,猪舌表面几乎不存在白色乳状液,激光共聚焦图像也证实了猪舌表面的乳液已基本冲洗完。PGPR浓度越高,W/O HIPEs在猪舌上的保留时间越长,乳液的完全洗脱需要7 min,红色区域减少得更为缓慢,说明口腔黏附性的增加^[30]。猪舌组织本质上为疏水性材料,但在舌头表面附着一层黏液,其中的黏蛋白被认为是主要的润滑成分,容易黏附到各种表面^[31]。但在本实验中由于乳液和猪舌的制备和保存问题,猪舌表面可能不再含有黏液层,因此此处不考虑乳液在黏液层的穿透能力差异。由图4(c)可见,P-4乳液润湿得较快,高浓度PGPR稳定的乳液润湿时间更长。从图4(c)中可以观察到猪舌前表面的形态为具有高密度的菌状和丝状乳头,这增加了接触表面积和表面粗糙度,较强的表面疏水性促进了乳液在猪舌表面的黏附^[32]。此外,为了准确定量Na⁺的保留情况,在每个冲洗节点均测定了洗脱液中的Na⁺含量。图4(d)显示,在冲洗前期,P-4乳液中Na⁺含量较高,且增加速率高于其他两种乳液。在冲洗后期,由于唾液含量的增加,P-6和P-8乳液逐渐完全洗脱,洗脱液中Na⁺含量增加较快。PGPR浓度增加可以提高乳液在舌头表面的黏附性,促使更多的Na⁺停留在舌头表面被味觉感受器感知,提高乳液的咸味感知能力。

图4 不同浓度PGPR稳定的W/O HIPEs在猪舌上的黏附Fig.4 Adhesion of W/O HIPEs stabilized with different PGPR concentrations on pig tongue

2.5.2 水相体积分数对W/O乳液中Na⁺在猪舌上黏附的影响

图5显示了不同水相体积分数的W/O乳液在体外猪舌上的滞留情况。由图5(a)的宏观结构可知,在水相体积分数较低的W/O乳液(D-30和D-50)中,随着唾液的冲洗,乳液在猪舌表面的残留量显著减少。在冲洗3 min后,猪舌表面几乎不含有白色乳状液。由图5(b)可知,微观结构表现为红色区域的面积减小^[33]。但对于水相体积分数较高的W/O HIPEs(D-80),在洗脱3 min后,猪舌表面的乳液仍有大面积残留,表现为更强的黏附作用。由于水相体积分数较低的W/O乳液流动性较好,与舌头表面的结合力较低,降低了其在舌头表面的黏附作用。由图5(c)可知,D-30乳液的接触角仅为19.4°,在猪舌表面很快被润湿。随着水相体积分数的增加,乳液与唾液的接触角也增加。D-50乳液的接触角为33.1°,D-80高内相乳液的接触角为54.4°。水相体积分数的增加导致W/O乳液在舌头表面需要更长的润湿时间,可能延迟口腔感知咸味的时间。图5 (d)展示了不同洗脱时间节点上洗脱液中Na⁺的含量。对于D-30和D-50乳液。在洗脱的初始阶段,洗脱液中Na⁺含量显著增加,后逐渐进入平缓阶段,这是由于W/O乳液在猪舌表面的黏附能力较弱所导致的。对于D-80 HIPEs,洗脱液中Na⁺含量的增加更接近于S形曲线,在唾液含量较少时,不足以将W/O HIPEs从猪舌表面洗脱。随着唾液含量的增加,洗脱速度增加直至乳液完全从猪舌表面洗脱。洗脱液中Na⁺含量具有显著差异,主要是由于乳液本身所含有Na⁺含量的不同,2.2中ICP-OES的测试结果已经证明。对于流动态的W/O乳液,在舌头表面润湿时间较短,表明乳液在入口阶段很容易感知到咸味,但其黏附性较差,不利于咸味在口腔中的延长和持续感知;对于半固态的W/O HIPEs,在舌头表面需要较长的润湿时间,代表其在入口阶段不容易被感知到咸味,但其在舌头表面具有很强的黏附性,不容易被唾液冲洗,可以延长咸味在口腔中的感知。

图5 不同水相体积分数的W/O乳液在猪舌上的黏附Fig.5 Adhesion of W/O stabilized emulsions with different aqueous phase volume fractions on pig tongue

2.5.3 Na⁺含量对W/O乳液中Na⁺在猪舌上黏附的影响

图6展示了不同浓度NaCl稳定的W/O HIPEs在体外猪舌上的滞留情况。由图5(a)的宏观结构可知,在低浓度NaCl的W/O HIPEs(Na-10)中,唾液冲洗3 min后,猪舌表面残留的白色乳液大面积减小。微观结构表现为红色区域的面积减小[图6(b)]。随着NaCl浓度的增加,在Na-100和Na-200乳液中,乳液在不同洗脱时间节点的残留量都有所增加,表现为白色乳液残留量的增加和红色区域的增加。这代表NaCl浓度的增加可以在一定程度上提高乳液在猪舌表面的黏附。但对于Na-100和Na-200乳液,其在猪舌表面的残留量并无明显区别。不同乳液在猪舌表面的润湿特性和接触角如图6(c)所示。由图6(c)可见,Na-10乳液的接触角为46.0°,在猪舌表面润湿较快。而Na-100和Na-200乳液的接触角相近,分别为54.4°和53.3°,代表其在猪舌表面的润湿性无明显差别。NaCl浓度的改变对乳液的润湿性影响最小,不同乳液间接触角差异较小,在咸味感知过程中可以不考虑乳液润湿性的影响。图6(d)展示了不同洗脱时间节点上洗脱液中Na⁺的含量。洗脱液中Na⁺含量呈现显著区别,主要是由于乳液本身Na⁺含量不同。乳液中所含NaCl浓度的差异也是决定咸味感知的重要因素。增加乳液体系中NaCl浓度可以延长乳液在舌头表面的黏附,但主要影响因素还是乳液体系中NaCl浓度的增加加强了咸味感知。

图6 不同浓度NaCl稳定的W/O HIPEs在猪舌上的黏附Fig.6 Adhesion of W/O HIPEs stabilized with different NaCl concentrations on pig tongue

2.6 W/O乳液中Na⁺穿透黏蛋白层的扩散结果分析

图7为采用Transwell^®系统研究Na⁺穿过黏蛋白层的动态扩散结果。Transwell^®系统包括供体腔室和受体腔室,以及在供体腔室内铺开的唾液层^[34][图7(a)]。图7(b)展示了W/O乳液在Transwell^®系统中的扩散情况,通过接收室中Na⁺的浓度可测定W/O乳液穿过唾液层的动态扩散。图7(c)展示了不同浓度PGPR稳定的W/O HIPEs中Na⁺在唾液层的扩散。在扩散0～1.5 h时,不同乳液之间无明显差异。随着振荡时间的增加,Na⁺在P-4乳液中的扩散系数逐渐增加。PGPR浓度的增加会降低Na⁺在接收室的含量,不利于Na⁺穿过黏蛋白层。唾液层的作用是允许水、电解质和营养物质等小分子扩散的同时抵御病原体的入侵^[35]。然而,黏蛋白有多种相互作用,包括物理缠结和化学相互作用。这些相互作用可以延迟水、电解质和营养物质的自由扩散。黏蛋白的嵌入会显著降低Na⁺的扩散系数,Na⁺在黏蛋白层的扩散主要受到乳液结构本身性质的影响和乳液与黏蛋白的相互作用影响^[36]。由于W/O HIPEs不溶于水,其中Na⁺的穿透作用主要依靠于黏蛋白对W/O HIPEs结构的影响。在PGPR浓度较低时,唾液会严重破坏W/O HIPEs的结构,致使内水相中Na⁺释放出来,提高其在唾液中的穿透性;而高浓度的PGPR稳定的W/O HIPEs具有更致密的界面膜,同时其表观黏度也更高,容易黏附在唾液和滤膜表面,使得Na⁺穿透唾液层和滤膜层的含量降低。此外,探究了不同水相体积分数下W/O HIPEs在唾液层的穿透性。从图7(c)中可以看出,D-30乳液中Na⁺在接收室中的含量最高,随着水相体积分数的增加,Na⁺含量逐渐降低。此处,仍需考虑在D-30乳液中,Na⁺的质量浓度仅为448.3 mg/kg,而D-80 HIPEs中Na⁺质量的浓度为1 561.8 mg/kg。 Na⁺在水相体积分数较低的W/O乳液中穿透性显著高于W/O HIPEs。这可能主要依托于W/O乳液在水相体积分数较低时为流动的液体,表观黏度较低,有利于Na⁺在唾液层的扩散。在分析NaCl浓度对Na⁺穿透黏蛋白层的结果中,Na-200乳液在接收室中Na⁺含量最多。但在ICP-OES实验中,Na-200乳液中Na⁺质量浓度为 2 472.2 mg/kg,几乎为Na-100的1.58倍。然而在穿透实验4 h后,Na-200乳液Na⁺含量并未达到Na-100乳液1.58倍,说明Na-200乳液本身的性质也阻碍了其在唾液层的穿透。

图7 基于Transwell^®扩散系统的W/O乳液Na⁺跨黏蛋白层动态扩散Fig.7 Dynamic diffusion of Na⁺ from W/O emulsion across mucin layer using Transwell^® system

为了进一步分析W/O乳液中Na⁺在唾液层的穿透作用,在水浴振荡2 h后使用CLSM观察了在渗透膜上乳液和Na⁺的分布情况。使用Z轴扫描对渗透膜上下40 μm的厚度进行扫描,分析Na⁺在渗透膜上的穿透作用,实验结果见图8。图8中,红色荧光代表W/O乳液,可以看出乳液需要以微米级的尺寸穿过渗透膜;绿色荧光代表Na⁺。横轴为X轴荧光强度的叠加,竖轴为Y轴荧光强度的叠加。图8(a)显示,在P-8乳液中,X轴和Y轴叠加后的红色和绿色荧光强度都显著高于P-4乳液,代表在渗透膜上含有更多的P-8 W/O乳液残留,说明其穿透性较差。PGPR浓度的增加会使W/O乳液更多地黏附在唾液层表面,扩散系数较低。图8(b)显示,在D-30乳液中,X轴和Y轴的荧光强度也明显低于D-80高内相乳液,代表其在穿透膜上的黏附较少,乳液扩散系数较高。图8(c)显示,NaCl浓度对X轴和Y轴红色荧光分布并无明显区别,乳液在穿透膜上的黏附效果相似。研究表明,乳液在唾液层的黏附和穿透性质都会影响其咸味感知过程^[37]。通过减小乳液与黏蛋白的相互作用促使乳液中的Na⁺进入口腔味觉感受器中,可以增强W/O乳液的咸味感知。

图8 W/O乳液在振荡2 h后在Transwell^®滤膜上的穿透微观图Fig.8 Penetration micrograph of W/O emulsion on Transwell^® filter membrane after 2 h of shaking

2.7 W/O乳液的电子舌分析结果

使用电子舌评价了W/O乳液在各个感官维度下的评分,这些维度包括先味(咸味、酸味、苦味、涩味)和回味(丰富度、苦味回味和涩味回味),分析结果见图9^[38]。从图9可以看出,乳液的滋味比较丰富,主要包括咸味、鲜味、涩味和苦味,但基本不富有酸味。在不同浓度的PGPR稳定的W/O乳液中,咸味感知表现出一定的相似性,这可能是由于测试前乳液经过高倍数稀释,导致不同乳液之间的味觉差异被弱化。然而,随着PGPR浓度的增加,HIPEs的味觉感知出现明显变化。例如,图9(a1)和(b1)显示,P-4和P-6乳液在PCA分析中距离较近,表明它们的味觉特性较为相似;而P-8乳液则单独存在,说明高浓度的PGPR对乳液的味觉感知有显著调控作用。

图9 W/O乳液电子舌雷达图和主成分分析结果Fig.9 Electronic tongue radar diagrams and principal component analysis results of W/O emulsions

对于不同水相体积分数的W/O乳液,咸味感知也表现出显著差异。由图9(a2)可知,D-80 HIPEs由于水相体积分数较高,其咸味感知和味觉丰富度显著增强,这可能是由于水相中溶解了更多的风味物质。相比之下,D-30乳液的滋味感知较弱,这可能是由于其较高的油脂含量掩盖了水相的咸味。在图9(b2)中,D-80 HIPEs和D-30乳液的距离较远,进一步证实了水相体积分数对乳液味觉感知的显著影响。

此外,由图9(a3)可知,Na-200乳液由于其高浓度的NaCl,展现出最强的咸味感知能力,这表明高盐浓度能够显著增强乳液的咸味。然而,这种咸味增强的同时也伴随着涩味的增加,这可能是由于高浓度的NaCl对味觉受体的非特异性作用。

2.8 W/O乳液的感官评价结果

2.8.1 PGPR浓度对W/O乳液感官评价结果的影响

感官评价是评价食品咸味最有说服力和最常用的方法,用于味觉评价的感官分析方法包括标度法、偏好法、排序法、差异法和属性分析法^[39],也可用于评价乳液和乳液食品的咸味。盐的味觉感知需要考虑多种因素,如黏度、基质- Na⁺的相互作用和适应性,黏度的增加会减少Na⁺的扩散,并随后降低食物的味觉。本实验采用标度法快速评价乳液的质地、油脂风味和咸味感知。图10展示了不同乳液的感官评价结果。从图10中可以看出,所有乳液的总体接受度均较高,可以作为脂肪替代的食品进行应用。由于体系为W/O乳液,所有乳液都含有较为滑腻的油脂风味。由图10(a)可知,P-4乳液具有较强的咸味感知,但质地较差,导致其总体接受度也较低。PGPR浓度调控W/O HIPEs的咸味感知受到多种因素的影响。首先,较低的PGPR浓度会加速唾液蛋白对W/O乳液结构的破坏,导致水相中Na⁺释放到口腔中被感知,这是最为重要的影响因素,因为口腔中Na⁺的利用率直接增加。其次,较低PGPR浓度的W/O HIPEs表观黏度较低,容易被唾液润湿并穿过唾液层到达舌头表面的味觉接收器,但其在舌头表面的黏附性较差,不利于口腔中咸味的持久感知。

图10 不同PGPR浓度、水相体积分数和NaCl浓度稳定的W/O乳液感官评价结果Fig.10 Sensory evaluation of W/O emulsions stabilized with different PGPR concentrations, aqueous phase volume fractions and NaCl concentrations

2.8.2 水相体积分数对W/O乳液感官评价结果的影响

由图10(b)可知,水相体积分数不同的W/O乳液都具有良好的质地特性,其表面光滑无明显水分释出,水相体积分数较高的W/O乳液具有更强的咸味感知能力和更高的总体接受度。相对于液体状的W/O乳液,受试者更倾向于选择咸味较强、油脂风味较弱的半固体状的W/O HIPEs,这也为W/O HIPEs在食品中作为脂肪替代物的可行性提供了依据。W/O HIPEs因Na⁺含量更高拥有更强的咸味感知。在与唾液的相互作用中,W/O HIPEs也更容易被唾液蛋白瓦解乳液结构,促使水相中Na⁺释放。水相体积分数的增加也提高了W/O乳液的表观黏度,需要大量的唾液才可以润湿,在唾液层的穿透性也较差,不利于食物在入口时感知到强烈的咸味。但是,高黏度的W/O HIPEs在舌头表面具有更强的黏附性,在口腔中停留时间更久,可以延长口腔中的咸味感知。

2.8.3 NaCl浓度对W/O乳液感官评价结果的影响

由图10(c)可知,Na⁺含量的增加可以直接提供咸味,使其咸味感知分数远高于其他乳液,但其总体接受度基本相近。除去NaCl浓度增加可以直接提供咸味外,还可以通过调控乳液结构对咸味感知产生影响。NaCl浓度增加可以提高W/O HIPEs的稳定性,降低唾液对其结构的破坏程度,这会阻碍水相中Na⁺释放到口腔中;在舌头表面具有更强的黏附性,有利于延长口腔中的咸味感知。需要注意的是,低浓度的NaCl对乳液结构的影响较大,可以通过该机理调控乳液的咸味感知;但在高浓度NaCl条件下,仍以Na⁺含量的增加直接提供咸味感知为主要影响因素。本研究表明,乳液的基质是影响咸味感知的主要因素,通过改变乳液界面、水相和油相的组成,可以从微观、流变、摩擦、黏附和穿透等多个层面调控W/O乳液的咸味感知,为其作为减脂、减盐的脂肪替代物提供更多的理论依据和实际应用价值。

本研究系统探讨了油包水高内相乳液(W/O HIPEs)在模拟口腔加工条件下的Na⁺释放行为及其对咸味感知的影响。研究发现,W/O HIPEs中Na⁺的释放速率受乳液结构、唾液蛋白作用以及咀嚼时间的显著影响。唾液蛋白在初期限制了Na⁺的释放,但随着咀嚼时间增加,Na⁺释放量逐渐提升,且与去离子水相比唾液显著加快了Na⁺的释放速率。乳液的质地和结构对咸味感知有重要影响,高水相体积分数的W/O HIPEs因较高的黏度和较强的舌头表面黏附性,延长了Na⁺在口腔中的滞留时间,从而增强了咸味的持续性。乳化剂PGPR的浓度和NaCl浓度对乳液的黏附性及Na⁺释放行为具有调控作用,较低的PGPR浓度有利于Na⁺快速释放,但高浓度的PGPR则增强了乳液的黏附性,延长了咸味感知时间。此外,NaCl浓度的增加直接提升了咸味感知能力,但同时也影响了乳液的稳定性,需要在减盐设计中进行平衡。W/O HIPEs作为一种潜在的黄油替代物,能够在减少脂肪含量的同时增强咸味感知,满足消费者对健康和美味的需求。本研究系统揭示了W/O HIPEs在口腔加工中的动态行为及其对咸味感知的影响机制,旨在为新型减盐食品的开发提供理论支持及技术指导。

参考文献：略

制作：赵宇飞

编辑：李宁

审核：叶红波 张逸群