甘肃农业大学许卫兵 ACS Appl. Nano Mater.:pH/谷胱甘肽双响应肉桂醛二聚体纳米囊泡的制备及小麦尖孢镰刀菌防治与安全性评价

粮食安全是全球农业发展的核心议题，而作物病害一直是制约粮食产量与品质的关键因素。由尖孢镰刀菌等病原菌引发的枯萎病、根腐病分布广、危害重，每年造成大量经济损失，化学防控仍是当前最主要的应对手段。但传统农药普遍存在水溶性差、分散性不佳、叶面易流失、持效期短等问题，实际利用率低，严重制约绿色农业发展。

纳米技术为农药高效递送提供了新思路，纳米农药可提升溶解性、增强渗透性、实现控制释放，成为行业研究热点。然而，现有纳米载体多依赖人工合成高分子或无机材料，普遍存在生物相容性差、难以降解、制备复杂、成本较高等短板，且多数载体不具备环境响应能力，药物易提前释放，难以实现靶向递送，无法从根本上解决药效与安全的平衡问题。

研究表明，植物病原菌侵染部位会形成酸性微环境，同时真菌细胞内谷胱甘肽（GSH）浓度显著偏高，这为设计刺激响应型智能递送系统提供了天然依据。肉桂醛作为天然植物源活性物质，自身具有抑菌活性，且可通过希夫碱反应构建兼具 pH 与 GSH 响应性的两亲分子，具备自组装成纳米囊泡的潜力。但目前将肉桂醛基脂质体用于农药递送，同时系统研究响应释药、叶面粘附、抗雨冲刷、抑菌增效与生物安全性的一体化研究仍较为缺乏。

基于此，甘肃农业大学理学院许卫兵副教授团队在国际知名期刊《ACS Applied Nano Materials》上发表了一项研究。该研究以开发绿色、高效、安全的智能纳米农药为目标，构建植物源双响应纳米载体，为作物病害精准防控提供新策略。

材料合成

以肉桂醛和二乙烯三胺为原料，在乙醇中室温反应 12 小时，通过一步希夫碱缩合制备两亲性CDC，经透析、冻干得到纯品。再采用乙醇注射法，将 CDC 乙醇溶液注入水中，自组装形成CDC‑d 脂质体纳米囊泡。采用反溶剂沉淀法，将 CDC 分别与香芹酚、戊唑醇的乙醇溶液混合注入水中，搅拌后透析除去游离药物与溶剂，最终得到CDC‑d / 香芹酚和CDC‑d / 戊唑醇载药纳米粒，制备过程简单、绿色、温和。

方案. 肉桂醛脂质体体系的制备

核磁共振氢谱（¹H NMR）：肉桂醛结构单元的化学位移出现在 6.0~8.3 ppm 区间，二乙烯三胺结构单元的信号峰位于 1.2~4.3 ppm 处；缩合反应生成的亚胺键（N=CH）上氢原子的化学位移为 9.7 ppm，该峰呈现明显的二重分裂峰，证明肉桂醛与二乙烯三胺发生缩合反应，生成肉桂醛 - 二乙烯三胺 - 肉桂醛（CDC）。

高分辨质谱（HRMS）：实测分子量与理论值一致，CDC 结构被精准证实。

图 . 游离 CDC 的核磁共振氢谱 (a) 与高分辨质谱 (b)。

紫外 - 可见吸收光谱（UV-Vis）：游离戊唑醇与香芹酚的最大吸收波长分别为 255 nm 和 271 nm，而 CDC-d / 戊唑醇与 CDC-d / 香芹酚的最大吸收波长均为 297 nm，载药后药物特征峰被掩盖，说明CDC 囊泡可保护药物免受紫外线破坏。

图. 不同浓度下游离 CDC (a)、TEB (b) 和 CAR (c) 的乙醇溶液紫外光谱；CDC-d (d)、CDC-d-TEB (e) 和 CDC-d-CAR (f) 的水溶液紫外光谱。

载药量测试：两种药物的峰面积与浓度均呈现良好的线性关系，相关系数R²均达到 0.999。通过高效液相色谱测得香芹酚载药量 30.2%，戊唑醇载药量 25.6%，证明药物成功负载。

图. 游离 CDC (a、d)、TEB (b、e) 和 CAR (c、f) 的高效液相色谱图及标准曲线；CDC-d/TEB (g) 和 CDC-d/CAR (h) 的高效液相色谱图。

傅里叶变换红外光谱（FT-IR）：CDC-d / 戊唑醇的谱图中同时出现戊唑醇与 CDC 的特征吸收峰，证实戊唑醇成功负载于 CDC-d 中；在 CDC-d / 香芹酚的红外图谱里未出现明显峰位偏移，说明香芹酚与 CDC 之间未发生显著化学反应，进一步证明香芹酚已成功包封于 CDC-d 内部。

X 射线衍射（XRD）：CDC-d 为无定形结构；纯戊唑醇则呈现多个尖锐且强度较高的衍射峰，其中 16.4°、25.6°、28.9° 处的衍射峰分别对应戊唑醇的 (001)、(110)、(300) 晶面，说明戊唑醇结晶度较高；CDC-d / 戊唑醇在 16.4° 处可观测到微弱衍射峰，证明戊唑醇已成功负载，但整体图谱无明显尖锐衍射峰，说明载药后材料结晶度大幅下降；CDC-d / 香芹酚的衍射峰峰形宽泛，同样属于无定形结构。

图. CDC‑d (a)、CDC‑d/TEB (b) 和 CDC‑d/CAR (c) 的傅里叶变换红外光谱；CDC‑d、CDC‑d/TEB 和 CDC‑d/CAR (d) 的 X 射线衍射图谱。

热重分析（TGA/DTG）：CDC-d / 戊唑醇与 CDC-d / 香芹酚的热分解行为主要由载体 CDC-d 主导；与空白 CDC-d 相比，两种载药样品第一阶段主要热分解过程的失重量有所增加，额外失重的温度区间与两种农药的热分解区间基本一致，证实药物成功负载；同时，载药纳米颗粒中已无纯戊唑醇、香芹酚的特征热分解峰，说明药物在载体内以分子态或无定形状态分散，并非简单物理混合。

图. CDC‑d、CDC‑d/TEB 和 CDC‑d/CAR 的热重曲线（a 和 b）与微商热重曲线（c 和 d）。

粒径与 Zeta 电位测试：连续 5 天对各样品的粒径与 zeta 电位进行监测，5 天内所有样品的电位波动幅度均小于 3%，CDC-d、CDC-d / 戊唑醇、CDC-d / 香芹酚的平均 zeta 电位分别为 + 30、+20、+10 mV；粒径 CDC-d约160 nm、CDC-d / 戊唑醇约100 nm、CDC-d / 香芹酚约180 nm，载药后粒径变化与药物分子性质相关。

图. CDC‑d (a)、CDC‑d/TEB (b) 和 CDC‑d/CAR 的粒径与 Zeta 电位。

扫描电子显微镜（SEM）：CDC-d、CDC-d / 戊唑醇、CDC-d / 香芹酚均呈球形颗粒；CDC-d / 戊唑醇与 CDC-d / 香芹酚的粒径分布相对均一，颗粒表面更为光滑，但样品中同样存在少量颗粒团聚现象；在 pH=5 和 20 mM GSH 下均发生解体，双响应特性成立。

图. CDC‑d、CDC‑d/TEB 和 CDC‑d/CAR 分别经 20 mM DTT 与 pH=5 草酸处理前后的形貌图。

图. CDC-d（a）、CDC-d/TEB（b）和CDC-d/CAR（c）的SEM图像。用DTT（20mM）和草酸（pH=5）处理30分钟后CDC-d、CDC-d/TEB和CDC-d/CAR的SEM图像（d）。

体外累积释药测试：在pH=5 条件下 12 h CDC-d / 戊唑醇释放率达到 100%、CDC-d / 香芹酚释放率达到 85%；在 GSH 条件下相同时间内两种药物的累计释放率分别为 40% 与 60%，体系实现可控、快速、响应型释放。

图. 在 pH=5 和 20 mM 谷胱甘肽条件下，CDC‑d/TEB（a）和 CDC‑d/CAR（b）的累积释放率。

对尖孢镰刀菌的抑制效果

菌落生长抑制实验：纯 CDC-d 组与对照组的抑菌率无显著差异，说明空白载体 CDC-d 对尖孢镰刀菌的抑菌能力有限；CDC-d / 香芹酚组的菌落生长速度明显放缓，而 CDC-d / 戊唑醇组的菌落几乎停止生长，抑菌效果显著。

图2. 20μg/mL不同处理组在不同时间的菌落图像。

丙二醛（MDA）含量测定：经 CDC-d 处理后，尖孢镰刀菌体内的丙二醛含量为 0.204 μmol/L，是对照组的 1.48 倍；CDC-d / 戊唑醇、CDC-d / 香芹酚菌株丙二醛含量进一步大幅升高，分别达到对照组的 2.56 倍与 2.63 倍，说明纳米颗粒可破坏真菌细胞膜。

核酸泄漏量测定：核酸泄漏量的变化趋势与丙二醛释放规律基本一致，CDC-d、CDC-d / 戊唑醇、CDC-d / 香芹酚处理组的核酸泄漏量分别为对照组的 1.18 倍、1.54 倍和 1.55 倍，证实基于 CDC-d 构建的纳米体系可破坏真菌脂质细胞膜，引发胞内物质外流，最终诱导真菌细胞凋亡。

图. 分别在第2、4和6天，CDC-d、CDC-d/TEB和CDC-d/CAR处理的尖孢镰刀菌的菌落直径（a）、抑制率（b）、MDA含量（c）和核酸泄漏（d）。第6天，CDC-d/CAR的抑制率达到40.35%。

PI 荧光染色：清水对照组的孢子几乎未观察到红色荧光；经 CDC-d 处理后，孢子的荧光强度明显提升，而 CDC-d / 戊唑醇与 CDC-d / 香芹酚处理组的荧光信号更强；CDC-d、CDC-d / 戊唑醇、CDC-d / 香芹酚组的荧光强度分别为对照组的 6 倍、10 倍和 11 倍。

孢子萌发率测试：无菌水对照组的孢子基本全部萌发，而经三种样品处理后，仅有极少数孢子能够萌发；处理 7 小时后，与对照组相比，CDC-d 使孢子萌发率下降 81.26%；CDC-d / 戊唑醇、CDC-d / 香芹酚萌发率仅 8.91%、8.17%，抑制作用极强。

洋葱表皮侵染实验：与对照组相比，经 CDC-d、CDC-d / 戊唑醇、CDC-d / 香芹酚处理的洋葱表皮表面菌丝生长量极少，该结果与孢子萌发实验结论高度吻合，该纳米体系能够有效阻碍真菌菌丝侵染洋葱表皮这一关键过程，说明其可有效保护植物表皮物理屏障，对于阻断病原菌初次侵染具有重要作用。

图. PI染色后CDC-d、CDC-d/TEB和CDC-d/CAR处理的尖孢镰刀菌孢子的荧光图像（a），以及通过ImageJ分析获得的平均荧光强度（b）应用CDC-d/TEB和CDC-d/CAR；用CDC-d、CDC-d/TEB和CDC-d/CAR处理7小时后尖孢镰刀菌孢子萌发的图像（c）；用CDC-d、CDC-d/TEB和CDC-d/CAR处理48小时的尖孢镰刀菌孢子穿透洋葱表皮的图像（d）。

图. 经 CDC‑d、CDC‑d/TEB 和 CDC‑d/CAR 处理 7 小时后尖孢镰刀菌的孢子萌发率。

纳米颗粒在小麦叶片表面的润湿、附着性能及抑菌效果

接触角测试（CA）：纯水、CDC-d、CDC-d / 戊唑醇、CDC-d / 香芹酚在叶片表面的接触角依次为 112.6°、96.1°、80.3°、93.5°。接触角整体减小，证明三种纳米颗粒溶液在叶片表面的润湿能力均得到显著提升。

叶片滞留量测定：CDC-d、CDC-d / 戊唑醇、CDC-d / 香芹酚的叶片滞留量分别为纯水组的 2 倍、1.8 倍和 1.25 倍，附着量显著提高。

高速摄像铺展观测：三种纳米颗粒均具备优异的叶面铺展能力，这与纳米颗粒独特的微观形貌和表面正电荷特性密切相关，小麦叶片表面蜡质层带微弱负电，而本体系纳米颗粒的 zeta 电位处于 + 20~+30 mV 区间，正负电荷产生静电吸附作用，促使液滴在叶面均匀铺展。

荧光成像耐雨测试：对于 CDC-d 组，模拟降雨前后的平均荧光强度分别为对照组的 1.3 倍与 1.1 倍，降雨后荧光强度仅下降 2.13%；CDC-d / 戊唑醇与 CDC-d / 香芹酚的荧光强度衰减率分别为 2.33% 和 3.15%，说明三种载药纳米颗粒均可牢固附着在小麦叶片表面，耐雨水冲刷能力优异，有助于延长农药在叶面的持效期、提升药剂利用率。

扫描电镜观察（SEM）：淋洗后叶片表面的纳米颗粒数量与密度有所下降，但仍有大量颗粒稳定附着于叶面，证明载药体系与叶片之间存在较强的相互作用力，不易被雨水冲刷脱落。

离体叶片抑菌实验：CDC-d / 戊唑醇与 CDC-d / 香芹酚则可有效遏制病斑蔓延，叶片受侵染面积始终维持在较低水平，这表明基于 CDC 构建的载药纳米颗粒，能够有效抑制尖孢镰刀菌在小麦叶片上的生长与扩散。

图. 小麦叶片上的水、CDC-d、CDC-d/TEB和CDC-d/CAR的接触角（a）和保留质量（b）；用CDC-d、CDC-d/TEB和CDC-d/CAR处理的小麦叶片在模拟雨水侵蚀前后的SEM图像（c）。

图. CDC-d、CDC-d/TEB、CDC-d/CAR 与小麦叶片接触的高速摄像图。

图. 经 CDC-d 处理的小麦叶片明场图 (a)、荧光图 (b) 及平均荧光强度 (c)；经 CDC-d/TEB 处理的小麦叶片明场图 (d)、荧光图 (e) 及平均荧光强度 (f)；经 CDC-d/CAR 处理的小麦叶片明场图 (g)、荧光图 (h) 及平均荧光强度 (i)（每组小麦叶片从左至右依次为对照组、淋洗前、淋洗后）。

图. 经 CDC-d、CDC-d/TEB、CDC-d/CAR 处理并接种尖孢镰刀菌的小麦叶片，在不同时间下的形态照片 (a) 与病斑直径统计结果 (b)。

生物安全性评价

溶血试验：（1）CDC-d、CDC-d / 香芹酚、CDC-d / 戊唑醇的溶血率均随浓度升高而增大，呈现出明显的浓度依赖性；（2）CDC-d / 香芹酚与 CDC-d / 戊唑醇的溶血率高于空白载体 CDC-d；（3）三种样品的溶血活性由低到高依次为：CDC-d＜CDC-d / 香芹酚＜CDC-d / 戊唑醇；（4）当样品浓度低于 200 μg/mL 时，溶血率均不足 5%，符合生物安全标准，该浓度即为该系列载药颗粒的溶血安全临界浓度。

斑马鱼急性毒性试验：与清水对照组相比，CDC-d、CDC-d / 戊唑醇及 CDC-d / 香芹酚对斑马鱼几乎无不良影响；其中 CDC-d 与 CDC-d / 戊唑醇在 96 小时内未表现出明显毒性；CDC-d / 香芹酚组在培养 72 小时和 96 小时时，斑马鱼死亡率分别为 10% 和 15%，表明CDC 载体本身具备良好的水生生物安全性，载药纳米颗粒产生的毒性主要来源于其所负载的农药有效成分。

图. CDC、CDC-d/CAR、CDC-d/TEB 的溶血实物图 (a)（从左至右：阴性对照组、100 μL/mL、200 μL/mL、500 μL/mL、800 μL/mL、1000 μL/mL、阳性对照组）及溶血率 (b)；不同时间下 CDC-d、CDC-d/TEB、CDC-d/CAR 处理组斑马鱼的死亡率 (c)。

FDA/PI 活死细胞染色：与对照组相比，CDC-d、CDC-d / 香芹酚、CDC-d / 戊唑醇处理组细胞的乙酸荧光素荧光信号偏弱，碘化丙啶荧光信号偏强，说明各组活细胞数量少于对照组，死细胞占比更高。证实三种材料均具备良好的生物安全性。

图. FDA/PI活染色后用不同样品处理的BMEC的荧光图像（a）和ImageJ的平均荧光强度分析（b）。

该研究成功制备pH/谷胱甘肽双响应 CDC-d 纳米囊泡，可高效负载戊唑醇与香芹酚，载药量分别达 25.6%、30.2%。该纳米体系润湿性、叶面附着性与耐雨水冲刷能力优异，能破坏尖孢镰刀菌细胞膜，显著抑制菌落生长与孢子萌发，对小麦病害防控效果突出。该材料在安全浓度下溶血风险低，对斑马鱼及正常细胞毒性微弱，生物安全性良好。该植物源智能纳米农药制备简便、性能优良，具备田间应用潜力。

引用信息：

ACS Appl. Nano Mater. 2025, 8, 24088−24099

DOI号（在线访问）：

撰稿：李颖（仲恺农业工程学院，2024级制药与精细化工研究生）

审核：左继浩（仲恺农业工程学院，化工与材料学院专任教师）

投稿邮箱：zuojihao@zhku.edu.cn

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