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PBJ | 河北农业大学张彩英/李喜焕团队揭示GmDOF3.1-GmCPX模块调控大豆结瘤与固氮能力的分子机制

2026-06-24 11:35:18

大豆（Glycine max）是全球最重要的豆科作物，为人类提供超过 50% 的食用油和 25% 的植物蛋白。大豆独特的共生固氮系统能为其生长提供 50%-60% 的氮素营养，对农业可持续发展具有重大意义。在根瘤形成和固氮过程中，血红素（Heme）是豆血红蛋白的重要组分，对维持根瘤功能至关重要。尽管已知粪卟啉原氧化酶（CPX）是血红素合成途径的关键酶，但 CPX 基因在豆科植物根瘤中的具体功能及其上游调控网络仍不清楚。研究团队以此为切入点，通过对大豆根瘤转录组数据的挖掘，锁定了在根瘤中高表达的 GmCPX，试图破解其调控固氮能力的分子密码。

2026年5月14日，河北农业大学张彩英和李喜焕团队，在国际植物生物技术顶尖期刊《Plant Biotechnology Journal》上在线发表了题为“GmDOF3.1-GmCPX Module Regulates Nodulation and Nitrogen Fixation Abilities in Soybean”的研究论文。该研究首次鉴定到了一个调控大豆结瘤与固氮能力的关键模块GmDOF3.1-GmCPX。研究揭示了粪卟啉原氧化酶基因 GmCPX 通过促进血红素（Heme）合成来清除结瘤过程中的过氧化氢（ROS），从而优化根瘤菌生存环境的分子逻辑；同时证实了转录因子 GmDOF3.1 通过识别启动子区域的顺式元件负向调控 GmCPX 的表达。这一发现不仅填补了大豆共生固氮在氧化还原平衡调控方面的机制空白，也为通过分子手段改良大豆固氮效率、实现化肥减施增效提供了重要的遗传靶标。

GmCPX基因在大豆基因组中为单拷贝，编码385个氨基酸，含有Coprogen_oxidas保守结构域。组织表达谱显示，GmCPX在根瘤中表达量最高，叶片次之，这与它既参与叶片叶绿素合成又参与根瘤血红素合成的双重功能相吻合。在接种根瘤菌USDA110后，GmCPX的转录水平在6小时即显著上调，并在7至28天持续升高，表明它参与了从早期信号识别到根瘤发育和固氮的全过程。空间表达分析进一步揭示，未接种时GmCPX主要表达于根部维管束，接种后其表达范围扩展至根表皮和根毛；在根瘤中，原位杂交信号集中在侵染细胞区。亚细胞定位显示，在烟草叶片中GmCPX定位于叶绿体，而在大豆毛状根中则定位于线粒体和细胞核，这种定位转换与其在不同组织中执行血红素或叶绿素合成的功能需求一致。
图1 GmCPX的结构和表达分析
三个过表达株系中GmCPX表达量分别提升了3.84、4.40和4.25倍。接种根瘤菌后，过表达株系的侵染位点在48小时显著增多，5天时根瘤原基更密集，最终单株根瘤数、根瘤鲜重、固氮酶活性、全氮和铵态氮含量显著提高。透射电镜观察发现，过表达株系根瘤内根瘤菌数量增多，聚-β-羟基丁酸（PHB）积累增加，侵染细胞数量和面积提升。GmCPX的过表达显著提高了根瘤中血红素和血红蛋白的含量，而活性氧H₂O₂和丙二醛含量则显著下降。相反，RNAi株系中GmCPX表达量下降，根瘤数、鲜重、固氮酶活性等指标均显著降低，而H₂O₂和MDA含量升高。此外，一个在保守结构域发生错义突变的EMS突变体gmcpx也表现出根瘤数减少、固氮酶活性降低、血红素含量下降，而ROS含量升高。互补实验成功恢复了这些表型，证实了GmCPX的正向调控功能。
图2 GmCPX过表达稳定转基因株系结瘤固氮表型分析
为了进一步探究GmCPX在大豆根瘤中的调控机制，分析了其拷贝数和等位基因变异，在GmCPX序列中共鉴定到7个SNP，其中启动子区的三个SNP（-674A/T、-901T/G、-1033T/A）与结瘤固氮相关性状显著关联，且处于同一连锁区块，形成两种单倍型：Hap1（TTA，优势单倍型）和Hap2（AGT，非优势单倍型）。Hap1在地方品种中频率为30.3%，而在改良品种中升至53.7%，暗示其在育种中可能受到正向选择。表达分析显示，Hap1单倍型大豆中GmCPX的表达量显著高于Hap2，GUS报告基因实验也证实Hap1启动子活性更强。通过启动子分段缺失实验，研究团队将关键调控区域定位在Pro6片段（-593 bp至-1058 bp），而三个关联SNP恰好位于该区域内。进一步序列分析发现，这三个SNP导致了一个转录因子结合基序5′-T/AAAAG-3′的拷贝数变异：Hap1有9个拷贝，Hap2有10个拷贝。酵母单杂交和EMSA实验证实，转录因子GmDOF3.1能够识别并结合该基序，且对Hap2的结合能力强于Hap1。双荧光素酶报告系统进一步表明，GmDOF3.1负向调控GmCPX的表达，且对Hap2的抑制效应强于Hap1。
图3 GmCPX等位变异分析及启动子关键调控区域鉴定
在高效结瘤固氮品种Williams82（Hap1背景）中，GmDOF3.1在接种根瘤菌后表达被抑制，与GmCPX的表达模式恰好相反。在Williams82毛状根中过表达GmDOF3.1，根瘤数减少10.2%、根瘤鲜重降低10.9%、固氮酶活性下降12.5%、血红素含量减少10.4%；而RNAi干扰GmDOF3.1则获得相反结果，根瘤数增加8.4%、鲜重增加10.2%、固氮酶活性提升7.8%、血红素含量提高12.8%。在另一个大豆品种周豆18（Hap2背景）中也观察到类似趋势。重要的是，在GmDOF3.1过表达毛状根中，GmCPX的表达量显著下降；而在RNAi毛状根中，GmCPX表达量显著上升，直接证实了GmDOF3.1对GmCPX的负向调控。此外，对GmDOF3.1本身的等位变异分析发现，其上游存在两个SNP和一个Indel，可将重测序群体分为两种单倍型，且这两种单倍型在根瘤数、根瘤鲜重、根瘤干重等性状上存在显著差异，进一步证实了GmDOF3.1对结瘤固氮的调控作用。综合这些结果，研究团队提出了GmDOF3.1-GmCPX模块的工作模型：在低结瘤固氮能力的大豆（Hap2）中，GmDOF3.1通过10个5′-T/AAAAG-3′元件强烈抑制GmCPX表达，导致血红素合成减少，ROS积累增加，破坏根瘤菌生长的微环境，最终降低固氮效率；而在高结瘤固氮能力的大豆（Hap1）中，由于结合元件减少至9个，GmDOF3.1的抑制被部分解除，GmCPX表达升高，血红素合成增加，ROS被有效清除，为根瘤菌创造了适宜的生长环境，从而提升结瘤数和固氮酶活性。
图4 GmDOF3.1正向与反向遗传学功能分析
研究首次系统揭示了大豆粪卟啉原氧化酶基因GmCPX在结瘤固氮中的正向调控功能，并阐明了其上游转录因子GmDOF3.1通过结合启动子基序拷贝数变异实现精准负向调控的分子机制。研究第一次提供了DOF转录因子参与豆科植物结瘤固氮调控的直接实验证据，填补了CPX基因在豆科作物中上游调控机制的研究空白，更新了人们对根瘤中血红素来源与ROS稳态关系的认知。有意思的是，该模块在野生大豆向栽培大豆驯化过程中可能经历了负向选择，提示现代育种中大量施用氮肥可能无意中削弱了大豆的共生固氮能力。基于该模块的自然变异开发的KASP分子标记，为未来通过分子设计育种改良大豆的氮素利用效率提供了直接工具。
原文链接：https://doi.org/10.1111/pbi.70681