南京农业大学汪良驹教授团队:分子层面揭示5-ALA提高油桃雌蕊抗冻的调控机制

桃树等落叶果树的花期易受霜冻导致花果脱落，产量受损。南京农业大学园艺学院汪良驹教授团队题为“ALA up-regulated PpWRKY18 to enhance freezing tolerance of nectarine pistils”的研究论文在Horticultural Plant Journal上发布，揭示以5-ALA上调PpWRKY18，从而提高油桃雌蕊抗冻能力。为5-ALA在果树早春防寒、盛花后疏花以及保果提质中的应用提供了理论依据。

外源5-ALA预处理提高了油桃花器官的冷冻坚韧性

−3 ℃低温6小时处理后花朵尤其是雌蕊受到严重冻害，雌蕊呈水渍状，褐化，无生命迹象。而提前一周使用50mg/L的5-ALA进行预处理后，冻害症状显著减轻，明显降低雌蕊损伤程度。结果表明，5-ALA预处理有效增强了油桃开花阶段的抗冻性。

5-ALA预处理通过增强油桃雌蕊的抗氧化与渗透调节能力，显著提升其抗冻性。激活保护酶系统，其中POD活性提高2.5倍，SOD和CAT活性也分别提高11.9%和6.5%，清除低温积累的活性氧（如H₂O₂），并基本抑制膜脂过氧化产物MDA的生成，有效保护了细胞膜完整性。

同时，5-ALA还显著促进渗透调节物质的积累，使游离脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白分别较对照增加67.9%、36.4%和35.6%，维持细胞渗透平衡与氧化还原稳态，从而增强对冷冻胁迫的耐受力。

鉴定PpWRKY18在油桃雌蕊耐冻性中的可能调节功能

通过RNA-seq分析和RT-qPCR检测，筛选到一个响应低温和5-ALA处理的关键转录因子PpWRKY18。组织特异性表达分析显示，PpWRKY18在桃花雌蕊和雄蕊中表达水平最高。GUS与RT-qPCR检测显示，PpWRKY18启动子活性受到低温和5-ALA刺激，GUS基因表达水平显著增加。

PpWRKY18的过度表达提高了转基因烟草植物的抗冻性

在烟草中异源过表达(OE)-PpWRKY18能够显著缓解低温对植株的伤害。5-ALA处理可以显著提升低温下烟草相关同源基因表达水平，提高植株抗氧化酶活性与渗透调节物质含量，减少活性氧和丙二醛的积累，增强转基因烟草的抗冻能力，说明(OE)-PpWRKY18是受5-ALA调控并能提高植物抗冻性的重要转录因子。

PpWRKY18和PpCBF1之间的相互作用

研究发现，冷响应CBF通路的核心基因PpCBF1受到低温与5-ALA的诱导。Y2H、BiFC、LCI和Pulldown等试验证实，PpWRKY18和PpCBF1在蛋白质水平上存在互作。Y1H试验表明，PpCBF1作为转录因子靶向结合PpP5CS1和PpCOR1启动子，调控两个抗冻功能基因表达。

通过Y1H、EMSA和DLR试验，我们发现，PpWRKY18能特异性结合到PpPOD41启动子上的W-box，正向激活该基因表达。这为5-ALA诱导桃花雌蕊氧化平衡提供了分子依据。

PpC3H37 在PpWRKY18上游发挥作用并激活其表达

通过酵母核文库筛选，发现一个锌指蛋白转录因子PpC3H37。RT-qPCR与GUS结果显示，proPpC3H37受低温和5-ALA正调控。Y1H、EMSA和DLR证明，PpC3H37可以结合proPpWRKY18并正向调节其表达。

花朵是果树产量基础，花冻则产量受损。本研究首次将5-ALA运用于防止桃树倒春寒危害，并且证明，提前一周基部处理，5-ALA可以通过木质部运输到雌蕊，缓解低温胁迫伤害，揭示出响应低温和5-ALA的关键转录因子PpC3H37和PpWRKY18，为5-ALA在果树早春防寒、盛花后疏花以及保果提质中的应用提供了理论依据。