河南农业大学|肝复乐胶囊通过抑制氧化应激、炎症反应与细胞凋亡减轻AFB1诱导的小鼠中毒性肝损伤

AFB1是由黄曲霉、寄生曲霉等产生的霉菌毒素，被世界卫生组织下属国际癌症研究机构（IARC）列为1类致癌物，广泛存在于霉变的食物与动物饲料中，对全球食品安全构成严重威胁。肝脏是AFB1代谢的核心靶器官，其经肝脏CYP450酶系代谢生成的高毒性环氧代谢物AFBO，可与DNA、RNA和蛋白质结合，引发剧烈的氧化应激、炎症级联反应与肝细胞凋亡，最终诱发肝损伤、肝纤维化甚至肝细胞癌（HCC）。数据显示，全球5%~28%的HCC病例与AFB1暴露相关，而我国是全球HCC发病率与发病人数最高的国家，膳食黄曲霉毒素污染是主要诱因之一。目前临床上尚无针对AFB1中毒的特效解毒剂，现有保肝药物存在治疗窗口窄、长期使用副作用显著等局限。中药及天然产物因多成分、多靶点、协同作用、副作用小的特点，在肝脏疾病防治中展现出独特优势。肝复乐胶囊是我国获批用于中晚期肝癌辅助治疗的经典中药复方，由21味中药与动物源成分组成，已被证实具有抗肿瘤、抗肝纤维化、抗炎抗氧化等多种药理活性，但其对AFB1诱导的中毒性肝损伤是否具有治疗作用，及其深层分子机制尚未见系统报道。

3.1 GFL缓解AFB1诱导的小鼠肝损伤

本研究将C57BL/6小鼠随机分为四组：对照组（CTR）、AFB1组（1 mg/kg/d AFB1）、GFL组（2.34 g/kg/d GFL）和AFB1+GFL组（2.34 g/kg/d GFL + 1 mg/kg/d AFB1），试验持续30天。结果显示，AFB1慢性暴露导致小鼠肝脏重量、肝脏指数显著升高，血浆ALT、AST等肝损伤核心标志物活性大幅上调，肝脏TG、TCHO、LDL-C等脂质代谢指标异常，肝组织出现肝细胞气球样变、核固缩、肝索排列紊乱、炎症细胞浸润等严重病理改变，同时伴随胆汁酸代谢紊乱。而GFL灌胃处理可显著逆转上述异常，恢复肝脏生化指标与组织病理结构，有效改善慢性AFB1暴露诱导的肝损伤（图1）。

图1. GFL减轻AFB1诱导的肝损伤。

3.2 GFL减轻AFB1诱导的肝细胞毒性

为进一步验证GFL的保肝作用，本研究采用小鼠正常肝细胞AML12开展体外实验。结果显示，AFB1处理可显著降低肝细胞活力，上调细胞内ALT、AST活性，诱发明显的肝细胞毒性；而25 μg/mL GFL预处理可有效抑制AFB1诱导的肝细胞活力下降，降低细胞内转氨酶水平，在细胞层面直接证实了GFL对AFB1诱导肝细胞毒性的保护作用（图2）。

图2. GFL预处理可减轻AFB1诱导的肝细胞毒性。

3.3 GFL通过激活Keap1/Nrf2通路减轻AFB1诱导的氧化应激

AFB1暴露显著升高了小鼠肝脏与AML12肝细胞中ROS、脂质过氧化终产物MDA的水平，同时降低了抗氧化酶SOD活性与内源性抗氧化物质GSH的含量，下调了抗氧化通路核心基因Nrf2、HO-1、NQO1的表达，上调了通路抑制因子Keap1的表达。而GFL处理可显著逆转上述氧化应激相关指标的异常，有效激活Keap1/Nrf2抗氧化信号通路，增强肝细胞的内源性抗氧化防御能力，抑制AFB1诱导的氧化应激损伤（图6）。

图6. GFL减轻AFB1诱导的肝细胞氧化应激。

3.4 GFL通过抑制IL6/STAT3通路减轻AFB1诱导的肝脏炎症与纤维化

AFB1暴露显著激活了小鼠肝脏与AML12肝细胞中IL6/STAT3炎症信号通路，大幅上调IL1β、IL6、TNF-α等促炎因子的mRNA与蛋白表达，同时升高了MMP13、TGFB1等纤维化相关基因的水平，诱发肝脏纤维化病变。而GFL处理可显著抑制STAT3的磷酸化激活，下调下游促炎因子与纤维化相关基因的表达，有效减轻肝脏炎症浸润与纤维化程度，证实GFL可通过抑制IL6/STAT3通路发挥抗炎抗纤维化作用（图7）。

图7. GFL抑制AFB1诱导的肝脏炎症和纤维化。

3.5 GFL抑制AFB1诱导的肝细胞凋亡

TUNEL染色与流式细胞术结果显示，AFB1暴露显著增加了小鼠肝脏组织与AML12肝细胞的凋亡率，同时上调了促凋亡蛋白Bax、Cyto-C、Cleaved-Caspase3、Cleaved-PARP的表达，下调了抗凋亡蛋白Bcl2的水平。而GFL处理可显著减少肝细胞凋亡，逆转凋亡相关蛋白与基因的异常表达，通过抑制线粒体依赖的凋亡通路，减轻AFB1诱导的肝细胞凋亡，进而缓解肝损伤（图8）。

图8. GFL抑制AFB1诱导的肝细胞凋亡。

3.6 多组学与分子实验验证GFL保肝作用的核心靶点与活性成分

通过网络药理学分析，本研究筛选得到GFL与药物性肝炎的270个共同作用靶点，其中42个核心靶点主要富集于氧化应激、炎症反应、细胞凋亡、组织纤维化相关通路，同时鉴定出GFL中排名前5的核心活性成分为槲皮素（QCT）、β-谷甾醇、山柰酚、木犀草素、豆甾醇（图3）。

转录组测序结果进一步证实，AFB1处理导致肝细胞上万条基因表达异常，而GFL预处理可显著逆转这些差异基因的表达模式，其调控的核心通路集中于氧化应激、炎症反应与细胞凋亡（图4，图5），与网络药理学预测结果高度一致。

分子对接与100ns分子动力学模拟结果显示，GFL的核心活性成分槲皮素可与IL6、STAT3蛋白形成稳定的氢键结合，结合能分别达-6.3 kcal/mol与-7.8 kcal/mol；体外细胞实验进一步证实，槲皮素可显著抑制AFB1诱导的IL6/STAT3通路激活与下游促炎因子基因的上调，是GFL发挥保肝作用的关键物质基础（图9，图10）。

图3. GFL和AFB1诱导的毒性肝炎共同靶点的网络药理学分析。

图4. GFL和AFB1诱导的毒性肝炎的GO及KEGG通路富集分析。

图5. GFL处理前后AML12细胞的转录组分析。

图9. QCT与IL6和STAT3的分子对接及分子动力学模拟。

图10. QCT抑制AFB1诱导的AML12细胞中IL6/STAT3信号通路的激活。

本研究系统阐明了肝复乐胶囊（GFL）通过抗氧化应激、抗炎、抗纤维化、抗凋亡多通路协同作用，缓解AFB1诱导的中毒性肝损伤的分子机制。研究证实，GFL可通过激活Keap1/Nrf2抗氧化通路增强肝细胞内源性抗氧化能力，通过抑制IL6/STAT3信号通路减轻肝脏炎症反应与纤维化进程，同时调控线粒体凋亡通路抑制肝细胞凋亡，多维度改善AFB1诱导的肝损伤。网络药理学、多组学分析与分子实验进一步明确，GFL中的核心活性成分槲皮素可通过特异性结合IL6与STAT3，抑制IL6/STAT3炎症通路的过度激活，是GFL发挥保肝作用的核心物质基础。本研究填补了GFL用于AFB1诱导中毒性肝损伤治疗的研究空白，为其临床拓展应用提供了坚实的理论依据，也为黄曲霉毒素中毒性肝损伤的防治提供了全新的中医药治疗策略。

河南大学基础医学院李攀、曹雨佳、侯一帆为该论文的共同第一作者，河南大学基础医学院聂小博副教授、中国融通医疗健康集团开封155医院侯俊卿教授为该论文的共同通讯作者。该项研究获得了河南省重点科技攻关项目（252102311056、252102310063、242102311153、242102310065）、开封市科技发展计划项目（2403091）、河南省医学科技省部共建项目与大学生创新创业计划项目的支持。