研究背景
单倍体诱导（Haploid induction, HI）是加倍单倍体（DH）育种技术的核心环节。DH育种能够使重组单倍型在短短两代内实现完全纯合，极大地缩短了育种周期，相比传统连续自交方法具有显著的时间优势。虽然通过花药或微托离体培养等体外技术可以产生单倍体，但由于这些方法受基因型限制严重、操作复杂且效率较低，难以在多种作物中广泛应用。
近年来，体内单倍体诱导技术取得了突破性进展。在模式植物玉米中，科学家已经成功鉴定出多个关键的诱导基因，包括MATRILINEAL (MTL)（也称为PLA1或NLD）、CENH3、DMP以及过氧化物酶基因ZmPOD65。然而，诱导基因在不同物种间的保守性存在差异。例如，MTL仅在单子叶植物中保守，而DMP介导的诱导机制虽在双子叶植物中得到验证，但在某些物种中的诱导频率仍有提升空间。ZmPOD65作为玉米中新发现的诱导基因，其在双子叶植物中是否具有同样的功能，此前尚缺乏实验证据。
论文概要
中国农业大学园艺学院任华中/刘兴旺团队在Journal of Integrative Plant Biology (JIPB)发表题为“Editing CsPOD7 triggers in vivo maternal haploid induction in cucumber”的论文，揭示了敲除黄瓜中的ZmPOD65同源基因CsPOD7能够成功触发体内母本单倍体诱导。该研究不仅为双子叶植物单倍体育种提供了新的基因靶点，也拓展了过氧化物酶介导的单倍体诱导机制在植物界的应用范畴。
主要研究结果介绍
CsPOD7基因的鉴定与突变体创制
研究人员首先在黄瓜基因组中鉴定了5个ZmPOD65的同源基因，其中CsPOD7（CsaV3_1G008260）与ZmPOD65的亲缘关系最近，蛋白质序列一致性为59.55%。RT-qPCR分析显示，CsPOD7在成熟花药中表现出极高的组织表达特异性，暗示其在雄性生殖发育中发挥重要作用。
为了探究该基因的功能，研究团队利用CRISPR/Cas9技术，在黄瓜品种“长春密刺”背景下创制了Cspod7纯合突变体。实验设计了两个针对CsPOD7第一外显子的sgRNA（图1A）。最终获得了两种突变类型：一种是导致3个氨基酸改变的12-bp替换，另一种是导致单个氨基酸改变的1-bp替换（图1B, C）。此外，载体中整合了由CaMV 35S启动子驱动的EGFP（增强型绿色荧光蛋白）标记，以便后期通过荧光筛选鉴定杂交后代中的单倍体。
Cspod7突变导致生理表型改变
生理生化分析表明，Cspod7突变体的过氧化物酶活性显著低于野生型（WT）。虽然突变体的花粉活力与野生型相近，但其花粉萌发率显著降低了约36%。这种授粉能力的下降直接导致了果实内种子数量的减少，且饱满种子的比例大幅下降，败育种子的比例明显升高（图1D–F）。这一表型特征与已知的多种体内单倍体诱导系（如zmpod65、dmp等）高度相似。
验证CsPOD7的单倍体诱导能力
研究团队首先通过Cspod7-1突变体的自交实验评估其HI潜力。通过流式细胞术对1,739株自交后代进行鉴定，成功发现了3株单倍体植株（图1H, I），而野生型自交后代中未检测到单倍体。
随后，为验证其作为母本单倍体诱导系（即通过雄配子失活诱导母本染色体加倍或发育）的能力，研究者以Cspod7纯合突变体为父本，与7个不同遗传背景的黄瓜种质（包括2个品种和5个纯系）进行杂交。由于突变体携带EGFP标记，而单倍体后代仅含有母本遗传物质，因此不带荧光。利用荧光标记筛选结合流式细胞术鉴定，结果显示其单倍体诱导率（HIR）在0.16%至0.2%之间（图1G-I）。形态学观察发现，这些单倍体植株虽然与二倍体相似，但株型更矮，叶片及花部器官显著变小（图1J–O）。
遗传起源确认与DH系产生
为了确认这些单倍体的母本来源，研究人员对两株单倍体苗进行了全基因组测序。SNP分析证实，单倍体后代中完全不存在父本（Cspod7突变体）的单核苷酸多态性位点，证明其确实源于母本染色体。此外，当以Cspod7作为母本进行杂交，或使用回补品系进行控制实验时，均未产生单倍体，进一步证明单倍体的产生是由父本CsPOD7基因功能缺失驱动的。最后，通过0.1%秋水仙碱处理单倍体胚根，研究团队成功获得了染色体加倍的DH品系，证明了该诱导系在实际育种中的应用价值。
全文总结与展望
本研究首次证明了过氧化物酶基因ZmPOD65的同源基因在双子叶植物中同样具有体内单倍体诱导功能。通过CRISPR/Cas9技术敲除CsPOD7，研究者成功构建了黄瓜母本单倍体诱导系，且该诱导能力不依赖于受体母本的基因型。
尽管目前CsPOD7在黄瓜中的诱导频率（约0.2%）相对较低，但这为双子叶植物DH育种提供了除DMP之外的重要替代方案。未来，研究团队计划通过创制Csdmp Cspod7双突变体，或联合敲除POD家族中的其他冗余成员，进一步挖掘基因间的协同效应，旨在大幅提升黄瓜乃至其他双子叶作物的单倍体诱导效率。这一发现显著丰富了植物体内单倍体诱导的分子工具点，对加速蔬菜作物改良具有重要意义。
研究团队与资助
该研究的第一作者为中国农业大学园艺学院的Sen Li和Shuai Yin。通讯作者为中国农业大学的刘兴旺（Xingwang Liu）教授和任华中（Huazhong Ren）教授。
该项研究得到了国家自然科学基金（32573049, 3202013014）、中国农业大学2115人才发展计划以及111引智计划的资助。
DOI链接：https://doi.org/10.1111/jipb.70276
