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HR·8.5|青岛农业大学王彩虹教授团队揭示独脚金内酯缓解苹果盐碱氧化损伤的调控新机制

2026-03-28 21:28:27

文献标题：The SL-MdDWARF53-MdbHLH1 module regulates MdAT1-mediated redox homeostasis and alkaline salt tolerance mechanism in apple

文献译名：独脚金内酯SL-MdDWARF53-MdbHLH1模块调控 MdAT1 介导的苹果氧化还原稳态与碱性盐胁迫耐受机制期刊名称：Horticulture Research发表时间：2026 年 03 月 11 日影响因子：8.5一作单位：青岛农业大学园艺学院；山东省园艺作物遗传改良工程实验室通讯作者：王彩虹教授、田义轲教授通讯邮箱：chwang6068@163.com；tianyike6068@163.com项目基金：本研究由国家自然科学基金项目（32472717）与山东省现代农业产业技术体系基金项目（SDAIT-06-06）资助。

研究背景

苹果（Malus domestica）作为全球重要的经济果树，其生长发育正日益受到土壤盐碱胁迫（高pH值与离子毒害协同作用）的严重威胁。盐碱环境会导致植物体内活性氧（如H₂O₂和O₂·⁻）过度积累，进而引发严重的氧化损伤，最终导致产量和品质急剧下降。独脚金内酯（SLs）作为一类新型植物激素，在调节植物生长发育及应对干旱、低温和盐碱等非生物胁迫中发挥着关键作用。然而，关于SLs如何介导植物耐受盐碱胁迫的具体分子机制，尤其是在多年生木本植物中的作用网络，目前仍缺乏深入探索。

目前，独脚金内酯的经典信号传导机制已被初步阐明，即受体感知SLs后促使抑制因子D53发生泛素化降解，从而解除其对下游基因的转录抑制。D53作为信号通路的核心节点，能够与包括碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）家族在内的多种转录因子互作以调控胁迫响应。同时，在植物清除活性氧的机制中，AT1基因通过调节H₂O₂外排在维持细胞内氧化还原稳态中扮演着重要角色，且该机制在多种禾本科作物中高度保守。尽管如此，bHLH转录因子在盐碱胁迫响应中的具体功能及其与D53的功能互作关系尚不明确；此外，AT1基因在苹果等多年生木本植物中的功能尚未见报道，其是否参与SL信号通路的调控网络更是一个亟待解决的科学问题。

解析苹果耐碱胁迫的分子机制并培育耐盐碱品种是当前保障苹果产业可持续发展的核心挑战。该研究通过整合转录组学和表观遗传学分析，系统揭示了SLs通过诱导抑制因子MdD53的降解，释放并激活转录因子MdbHLH1，进而直接促进下游靶基因MdAT1表达的完整调控网络。这一新鉴定的SL-MdD53-MdbHLH1-MdAT1信号通路，不仅首次在木本植物中证实了MdAT1通过促进H₂O₂外排来减轻氧化损伤的耐碱功能，还极大地拓展了对独脚金内酯信号传导网络的科学认知，为苹果耐盐碱分子育种提供了关键的基因靶点和全新的理论视角。

本研究首次揭示了独脚金内酯（SLs）通过诱导核心抑制因子MdD53降解，释放并激活转录因子MdbHLH1，进而直接促进下游靶基因MdAT1表达以高效清除活性氧（ROS），从而缓解氧化损伤并增强苹果耐盐碱胁迫的完整分子调控网络。

研究方法

2.1 试验材料准备与胁迫处理设计

为探究苹果响应盐碱胁迫的分子机制，研究采用组培的湖北海棠（Malus hupehensis）和‘嘎啦’（GL3）苹果植株作为试验材料。植株经过继代、生根及土壤炼苗后，转移至水培系统中进行试验。为评估独脚金内酯（SLs）的作用，试验设置了四个主要处理组：清水对照组、50 mM盐碱胁迫组（Na₂CO₃:NaHCO₃ = 1:1，pH 8.5）、盐碱结合1 μM GR245DS（SL类似物）处理组，以及盐碱结合10 μM TIS108（SL合成抑制剂）处理组。此外，研究还利用稳定转基因苹果株系（MdD53、MdbHLH1和MdAT1的过表达及RNAi干扰株系）以及瞬时转化幼苗，在相同的水培盐碱胁迫条件下进行培养，以观察表型变化并在特定时间点采集样本用于后续的分子与生化分析。

2.2 生理生化指标测定与转录组学分析

为评估胁迫下的氧化损伤程度及核心基因调控网络，研究施用了多种生理生化与分子检测方法。在表型与生理层面，通过CM-H₂DCFDA荧光探针观察根系活性氧（ROS）的积累，利用NBT和DAB染色分别检测叶片中O₂·⁻和H₂O₂的水平；同时结合TTC染色评估根际活力，并定量测定丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）等抗氧化酶的活性。在分子层面，提取不同处理下植株根和叶的总RNA进行转录组测序（RNA-seq），通过差异表达基因的GO和KEGG富集分析筛选核心响应基因，并利用RT-qPCR技术以MdActin为内参对关键候选基因的表达水平进行定量验证。

2.3 基因功能验证与分子互作机制解析

为深入解析MdD53、MdbHLH1与MdAT1之间的分子调控与互作机制，研究实施了一系列分子生物学试验设计。首先，克隆目标基因的编码序列并构建表达载体，通过根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导法获得稳定转基因苹果植株以验证基因功能。在分子互作层面，利用原核表达纯化的HIS-MdbHLH1蛋白与生物素标记的MdAT1启动子探针进行凝胶阻滞试验（EMSA）以验证DNA-蛋白结合，并结合本氏烟草叶片的双荧光素酶报告试验量化转录激活活性；同时，通过酵母双杂交（Y2H）和洋葱表皮细胞的双分子荧光互补（BiFC）试验，明确了MdD53与MdbHLH1之间的蛋白-蛋白相互作用。所有试验数据最终导入SPSS软件进行统计学分析，采用方差分析（ANOVA）及Fisher LSD或Student t检验，以P < 0.05作为判定统计显著性差异的标准。

研究结果

3.1. 独脚金内酯信号缓解盐碱胁迫引起的生长抑制和氧化损伤

表型改善：外源施用SL类似物GR245DS显著缓解了盐碱胁迫对平邑甜茶幼苗造成的生长抑制、叶片萎蔫和干重下降，而SL合成抑制剂TIS108则加剧了这些损害。
根系保护：盐碱胁迫严重抑制根系伸长和发育，GR245DS处理有效减轻了这种抑制作用，维持了较长的总根长和较多的根尖数，而TIS108处理则进一步恶化了根系生长。
缓解氧化：盐碱胁迫导致根系和叶片中活性氧（ROS）大量积累及膜脂过氧化。GR245DS处理显著降低了H₂O₂和O₂·⁻水平及MDA含量，维持了根际活力。
激活抗氧：GR245DS处理显著提高了SOD、POD和CAT等关键抗氧化酶的表达和活性，并上调了耐碱基因MdAT1的表达，从而通过增强内源抗氧化系统来清除ROS。

研究表明，外源施用独脚金内酯类似物GR245DS能够有效缓解盐碱胁迫对苹果幼苗造成的生长抑制和根系损伤。在生理层面，GR245DS通过显著提升SOD、POD和CAT等关键抗氧化酶的活性，上调耐碱基因MdAT1的表达，有效清除了体内过量积累的活性氧（H₂O₂和O₂·⁻），降低了膜脂过氧化程度，从而维持了细胞的氧化还原稳态和根际活力。相反，SL合成抑制剂TIS108则加剧了盐碱胁迫引起的氧化损伤和生长抑制。这些结果证实了SL信号通过协同激活内源抗氧化系统介导植物对盐碱胁迫的适应（Fig.1）。

图1. 外源GR245DS和TIS108对盐碱胁迫下平邑甜茶幼苗生长和生理的影响。(A) 对照、盐碱胁迫以及GR245DS或TIS108处理下平邑甜茶幼苗的生长表型；(B) 萎蔫率；(C) 干生物量；(D) 总根长；(E) 根尖数。(F) 根系中ROS荧光信号；(G) 根际活力的TTC染色；叶片ROS检测的NBT和DAB染色；(H-K) 处理下抗氧化酶基因的相对表达水平：(H) MdSOD；(I) MdPOD2；(J) MdCAT1；(K) MdAT1。数据代表三个生物学重复的平均值 ± SD。不同小写字母表示根据Fisher的LSD检验具有显著性差异（P < 0.05）。比例尺：5 cm (A)，1 cm (F)，1 mm (G)。

3.2 盐碱胁迫下SL调控核心基因网络的转录组分析

基因筛选：通过对不同处理下的幼苗进行RNA-seq分析，利用韦恩图筛选出102个共同响应盐碱胁迫、GR245DS和TIS108处理的核心差异表达基因（DEGs）。
功能富集：GO和KEGG富集分析表明，这些DEGs主要富集于细胞和代谢过程、膜组分、结合与转运活性，以及植物-病原体互作和植物激素信号传导等通路。
核心鉴定：结合加权基因共表达网络分析（WGCNA），在响应盐碱和GR245DS的模块中鉴定出关键转录因子MdbHLH1，其表达受盐碱胁迫和GR245DS双重强烈诱导，并经RT-qPCR验证为核心响应基因。

为解析SL信号在盐碱胁迫下的调控网络，研究对不同处理的苹果幼苗进行了转录组测序分析。通过差异表达基因筛选与共表达网络分析（WGCNA），鉴定出102个核心响应基因，这些基因主要参与代谢过程、膜转运及激素信号传导等通路。进一步整合分析发现，转录因子MdbHLH1是一个关键的枢纽基因，其表达不仅受到盐碱胁迫的强烈诱导，还能被GR245DS显著上调，而TIS108则抑制其表达。这表明MdbHLH1是SL介导苹果盐碱胁迫响应网络中的核心调控因子（Fig.2）。

图2. 盐碱胁迫和GR245DS处理6小时后平邑甜茶植株的转录组分析。(A) 韦恩图显示盐碱胁迫和盐碱胁迫+GR245DS处理下共响应基因的分布；(B) 基于所有样本拓扑重叠的共表达聚类树状图，显示八个基因模块与不同处理之间的关联。模块-性状相关值范围从-1到1，括号内为P值；(C) 棕色模块中共表达基因的Cytoscape网络互作图；(D) 盐碱响应基因、转录因子和植物激素信号通路中差异表达基因（DEGs）的热图。

3.3 MdbHLH1通过直接激活MdAT1的表达增强苹果耐盐碱性

表型验证：过表达MdbHLH1的苹果株系在盐碱胁迫下表现出显著改善的生长状态和较低的萎蔫率，而RNAi干扰株系则表现出更严重的受害症状及根系生长抑制。
生理机制：组织化学染色和定量分析显示，过表达MdbHLH1显著减少了叶片和根系中H₂O₂和O₂·⁻的积累及细胞死亡，而RNAi株系中ROS水平大幅升高，证实其能有效缓解氧化损伤。
靶标激活：表达分析、酵母单杂交（Y1H）、凝胶阻滞试验（EMSA）及双荧光素酶报告试验共同证实，MdbHLH1能够直接特异性结合并转录激活下游关键耐碱基因MdAT1的启动子。

为明确MdbHLH1在耐盐碱中的功能，研究构建了其过表达和RNAi干扰苹果株系。表型和生理分析表明，过表达MdbHLH1能够显著降低植株在胁迫下的萎蔫率，大幅减少体内活性氧（H₂O₂和O₂·⁻）的积累并减轻细胞死亡；而敲降该基因则加剧了氧化损伤和生长抑制。分子机制探究进一步揭示，MdbHLH1能够直接结合下游耐碱关键基因MdAT1的启动子区域并激活其转录。这表明MdbHLH1通过直接调控MdAT1的表达来增强ROS清除能力，从而赋予苹果更强的盐碱耐受性（Fig.3）。

图3. MdbHLH1过表达增强耐盐碱性的表型和分子机制。(A) 正常和胁迫条件下WT和OE株系的表型；(B) 叶片的台盼蓝（细胞死亡）和DAB（H₂O₂积累）染色；(C) 盐碱胁迫下的萎蔫率；(D) 根长；(E) 根系中ROS荧光强度；(F) qRT-PCR检测MdAT1的相对表达；(G) Y1H试验显示MdbHLH1结合MdAT1启动子；(H) EMSA证实MdbHLH1特异性结合MdAT1启动子探针；(I-J) 双荧光素酶试验证明MdbHLH1激活MdAT1启动子。数据代表三个生物学重复的平均值 ± SD。不同小写字母表示根据Fisher的LSD检验具有显著性差异（P < 0.05）。比例尺：5 cm (A)，1 cm (C/D)。

3.4 MdAT1通过增强ROS清除赋予盐碱耐受性

正向调控：在盐碱胁迫下，MdAT1过表达株系表现出显著增强的耐受性，萎蔫率降低，根长和干重增加；而RNAi干扰株系则出现更严重的萎蔫、坏死及生长抑制。
清除ROS：染色及定量分析表明，MdAT1过表达显著降低了植株体内H₂O₂、O₂·⁻和MDA的积累水平，并减少了ROS荧光信号；相反，RNAi株系中ROS水平显著升高。

针对下游靶基因MdAT1的功能验证表明，该基因在苹果盐碱胁迫响应中发挥着关键的正向调控作用。在盐碱胁迫下，过表达MdAT1的植株展现出优异的生长状态，其萎蔫率显著降低，根系发育和生物量积累明显优于野生型。生理生化分析证实，MdAT1的过表达大幅降低了细胞内H₂O₂和O₂·⁻的含量以及膜脂过氧化水平，有效维持了根际活力。相反，MdAT1表达受抑的植株则遭受了更严重的氧化损伤。这些结果确证了MdAT1通过高效调控ROS清除机制来减轻氧化损伤，从而赋予植物盐碱耐受性（Fig.4）。

图4. MdAT1过表达增强耐碱性的表型和生理机制。(A) 对照（左）和胁迫（右）条件下WT和OE株系的表型；(B) 萎蔫率；(C) 干生物量；(D) 根长；(E) 检测H₂O₂积累的DAB染色；(F) 检测O₂·⁻积累的NBT染色；(G) 根系中ROS荧光信号；(H) 根际活力的TTC染色；(I) MDA含量的定量分析。(J) H₂O₂含量的定量分析；(K) O₂·⁻含量的定量分析。数据代表三个生物学重复的平均值 ± SD。不同小写字母表示根据Fisher的LSD检验具有显著性差异（P < 0.05）。比例尺：5 cm (A)，1 cm (E/G)，1 mm (H)。

3.5 MdD53作为SL信号的负调控因子拮抗MdbHLH1的功能

蛋白互作：通过CoIP-MS筛选及转录组数据分析锁定MdD53，随后利用酵母双杂交（Y2H）、双分子荧光互补（BiFC）和双荧光素酶等试验证实了MdD53与MdbHLH1之间存在直接的蛋白相互作用。
降解受控：免疫印迹分析表明，盐碱胁迫诱导MdD53蛋白积累，而外源SL处理促进其降解，SL合成抑制剂TIS108则阻断了这一降解过程。
负向调控：表型和生理分析显示，MdD53过表达株系在盐碱胁迫下表现出更严重的坏死和极高的ROS积累，而RNAi株系则表现出明显的抗性提升和ROS水平下降，证明其为耐盐碱的负调控因子。

进一步的研究揭示了SL信号通路核心抑制因子MdD53在盐碱胁迫中的作用机制。多种分子互作试验（Y2H、BiFC、LCI等）一致证实，MdD53能够与转录因子MdbHLH1发生直接的物理相互作用。蛋白质水平分析发现，MdD53的丰度受SL信号的严格调控，外源SL可诱导其降解。在功能层面，过表达MdD53会导致苹果植株在盐碱胁迫下积累大量活性氧，加剧叶片坏死和生长抑制；而敲降MdD53则显著提升了植株的ROS清除能力和耐盐碱性。这表明MdD53通过与MdbHLH1互作并削弱ROS清除能力，在苹果耐盐碱胁迫中发挥负向调控作用（Fig.5）。

图5. MdD53与MdbHLH1互作调控苹果耐盐碱性的分子机制。(A) Y2H验证MdD53与MdbHLH1之间的互作；(B) BiFC在烟草表皮细胞中证实MdD53-MdbHLH1互作；(C) 双荧光素酶报告系统定量测量互作强度；(D) 使用荧光素酶互补成像可视化蛋白互作；(E) 盐碱胁迫和SL处理下MdD53蛋白积累的蛋白质印迹分析；(F) 正常和胁迫条件下WT和OE株系的表型；(G) 根系中ROS荧光信号检测；(H) 叶片ROS检测的DAB和NBT染色；(I) H₂O₂含量的定量分析；(J) O₂·⁻含量的定量分析。数据代表三个生物学重复的平均值 ± SD。不同小写字母表示根据Fisher的LSD检验具有显著性差异（P < 0.05）。比例尺：5 cm (F)，1 cm (H)，1 mm (G)。

3.6 MdD53-MdbHLH1-MdAT1模块协同调控氧化胁迫响应

转录抑制：EMSA和双荧光素酶报告试验表明，MdD53的加入显著削弱了MdbHLH1对MdAT1启动子的结合能力及其转录激活作用，证实MdD53抑制了该调控途径。
遗传互补：瞬时转化试验显示，MdAT1过表达能部分逆转由MdD53过表达引起的生长抑制，证明MdbHLH1-MdAT1通路能够拮抗MdD53介导的负向效应。
生理协同：氧化应激指标与基因表达高度一致，MdD53过表达或MdbHLH1敲降导致ROS激增及MdAT1表达下降，而共表达MdAT1有效降低了由MdD53引起的ROS积累。

为系统阐明该调控模块的协同作用机制，研究从分子互作、基因互补和生理响应三个维度进行了深入探讨。体外和体内分子试验证实，MdD53通过与MdbHLH1结合，直接阻碍了MdbHLH1对下游靶基因MdAT1启动子的识别与转录激活。遗传互补与生理分析表明，过表达MdD53或敲降MdbHLH1均会抑制MdAT1的表达，导致植株体内H₂O₂和O₂·⁻大量积累并引发严重的生长抑制；而同时过表达MdAT1能够有效逆转MdD53过表达所造成的ROS激增和表型受害。这些结果完整勾勒出一条清晰的调控链条：MdD53通过抑制MdbHLH1的转录活性来下调MdAT1的表达，最终削弱了植物的ROS代谢与盐碱耐受能力（Fig.6）。

图6. MdD53-MdbHLH1-MdAT1调控模块在苹果耐碱性中的分子机制。(A) MdD53对MdbHLH1结合MdAT1启动子影响的EMSA分析；(B-C) 双荧光素酶报告试验检测MdD53对MdbHLH1介导的MdAT1激活的抑制作用；(D) 盐碱胁迫下通过瞬时过表达的不同遗传材料的表型比较；(E) 用于ROS检测的DAB和NBT染色；(F) H₂O₂含量的定量分析；(G) O₂·⁻含量的定量分析；(H) MdAT1基因的表达水平分析。数据代表三个生物学重复的平均值 ± SD。不同小写字母表示根据Fisher的LSD检验具有显著性差异（P < 0.05）。比例尺：5cm (D/E)。

研究创新性

1. 首次揭示独脚金内酯（SLs）调控多年生木本植物耐盐碱胁迫的分子机制。以往关于独脚金内酯（SLs）响应非生物胁迫的研究主要集中在拟南芥、水稻等一年生草本植物中，其在多年生木本植物应对盐碱胁迫中的作用及机制一直存在研究空白。本研究首次系统证明了外源施用SLs（GR245DS）能够显著提升苹果植株对盐碱胁迫的耐受性，明确了SLs通过激活内源抗氧化系统、减轻氧化损伤来发挥保护作用，极大拓展了SLs在木本植物中的生物学功能认知。

2. 鉴定并解析了一条全新的“SL-MdD53-MdbHLH1-MdAT1”完整信号通路。研究不仅停留在表型和生理层面，还通过转录组学和分子生物学手段，完整勾勒出了一条从激素信号感知到生理功能执行的全新调控链条：即SL信号诱导核心抑制因子MdD53发生泛素化降解，从而解除其对转录因子MdbHLH1的物理结合与抑制；被释放的MdbHLH1进而直接结合并激活下游靶基因MdAT1的启动子，最终通过促进活性氧（ROS）清除来赋予植物耐碱性。这一通路的发现为植物激素信号网络增添了重要的新成员。

3. 阐明了SL通路核心抑制因子MdD53在盐碱胁迫响应中的新功能与互作网络。传统研究多聚焦于D53/SMXL家族蛋白在调控植物分枝/分蘖等生长发育过程中的作用。本研究创新性地将其引入到木本植物的盐碱胁迫响应网络中，首次揭示了MdD53作为耐盐碱负调控因子的功能。同时，研究首次发现了MdD53与碱胁迫响应转录因子MdbHLH1之间的直接蛋白互作机制，拓宽了对D53蛋白作为跨通路信号整合枢纽的科学理解。

4. 首次在双子叶果树中鉴定并验证了经典耐碱基因AT1的同源基因及其上游调控机制。经典耐碱基因AT1（如水稻中的GS3）此前的研究几乎全部集中在禾本科作物（单子叶植物）中。本研究首次在苹果（双子叶木本植物）中鉴定并进行了MdAT1的功能验证，证实了其在进化上保留了通过促进H₂O₂外排来维持细胞氧化还原稳态的核心耐碱功能。更重要的是，本研究首次将AT1基因与独脚金内酯（SLs）激素信号通路联系起来，解答了“AT1是否参与SL信号通路”这一未知的科学问题，为苹果耐盐碱分子育种提供了全新的关键靶点。