《乳业科学与技术》:中国农业大学郭慧媛教授等:ω-3多不饱和脂肪酸促肠上皮细胞增殖效应与分子机制

1. DHA对IEC-6细胞增殖的影响

IEC-6细胞在传代后8～10 h完成贴壁，约15 h恢复正常形态，24～48 h进入对数生长期，36 h后增殖逐渐减缓。因此，选择传代24 h后的细胞，分别采用DHA处理12、24、36、48 h，以评估其增殖活力。由图1A、B可知，与对照组相比，经DHA处理12 h和24 h后，IEC-6细胞活力显著升高（P＜0.01、P＜0.001），且呈浓度依赖性增强，尤其是100 μmol/L DHA处理24 h后，细胞活力提升将近4 倍，表明DHA可在24 h内明显促进IEC-6细胞增殖。由图1C、D可知，处理36 h后，细胞增殖受到抑制；处理至48 h时，细胞活力与对照组无显著差异。

为验证CCK-8结果，进一步采用EdU染色法检测细胞增殖情况。由图2可知，DHA处理24 h后EdU阳性细胞率显著提高（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001），且具有浓度依赖性，与CCK-8结果一致。因此，选取促增殖效果最显著的100 μmol/L DHA进行后续机制研究。

2. EPA对IEC-6细胞增殖的影响

由图3可知，10 μmol/L EPA处理12 h和24 h可显著促进细胞增殖（P＜0.05、P＜0.001），特别是处理24 h后，细胞活力提升3.5 倍；EPA处理36 h和48 h后，细胞活力也普遍与对照组无显著差异，与EdU染色结果（图4）一致，进一步证实10 μmol/L EPA在24 h内促进增殖效果最优，故选用该浓度进行后续机制研究。

3. DHA与EPA促进IEC-6细胞增殖的关键分子机制

为探讨DHA和EPA促增殖机制，本研究检测Wnt信号通路相关基因及蛋白表达。由图5可知，100 μmol/L DHA处理可显著上调IEC-6细胞中Myc、Ccnd1、Ctnnb1及GSK3β的mRNA相对表达水平，10 μmol/L EPA处理可显著上调Ccnd1、Ctnnb1、Axin2及Myc的mRNA相对表达水平（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001）。

WB分析进一步表明，2 种处理均能显著增加cyclin D1、β-catenin和c-Myc的蛋白相对表达水平，并降低p-β-catenin相对表达水平（图6A），这与蛋白条带灰度分析结果（图6B～E）一致。以上结果说明，DHA和EPA可通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进IEC-6细胞增殖。

本研究探讨了ω-3 PUFAs（DHA和EPA）在正常生理状态下对小肠上皮细胞IEC-6增殖的影响及其作用机制。结果表明，DHA和EPA在特定浓度和处理时间下可显著促进IEC-6细胞增殖，且该效应呈浓度依赖性。更重要的是，其促增殖机制与Wnt信号通路激活密切相关，为ω-3 PUFAs在肠道健康领域的应用提供了新的理论依据。

首先，本研究明确DHA和EPA对IEC-6细胞增殖的促进作用具有浓度和时间依赖性。DHA在100 μmol/L浓度下处理12 h和24 h可显著提高IEC-6细胞活力，而延长处理时间至36 h和48 h后，该效应减弱甚至出现抑制趋势。类似地，EPA在10 μmol/L浓度下处理12 h和24 h也可显著促进IEC-6细胞增殖，更长时间处理则未观察到显著促增值效应。这一结果与既往研究一致，表明ω-3 PUFAs的生物学效应强烈依赖于作用浓度和时间。短时处理可能通过调节细胞膜流动性及信号转导促进增殖，而长时间暴露可能导致代谢适应甚至氧化应激，从而减弱增殖效果。高浓度或持续处理还可能诱发凋亡等负面反应。因此，在实际应用中需严格控制剂量与处理时间，以优化ω-3 PUFAs的促增殖效果并避免潜在不良反应。

其次，通过CCK-8与EdU实验双重验证，本研究确认DHA和EPA对IEC-6细胞具有明确的促增殖作用，且2 种方法所得数据一致性较高，结果可靠。值得注意的是，DHA和EPA的最佳促增殖浓度存在差异：DHA为100 μmol/L，而EPA为10 μmol/L，这可能源于二者分子结构及代谢途径的不同。作为更长链的脂肪酸，DHA可通过影响细胞膜结构（如脂筏组装）调控膜相关信号转导，从而更高效地促进细胞增殖；而EPA则可能通过其代谢产物（如类二十烷酸和消退素）发挥抗炎与促增殖作用。例如，EPA衍生的前列腺素E3可通过激活前列腺素E受体促进增殖，而DHA更倾向于调控磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）等信号通路。未来研究可进一步解析DHA与EPA在细胞内的代谢差异及其对增殖调控的具体机制。

最后，本研究从分子层面阐明DHA和EPA通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进IEC-6细胞增殖的作用机制。Wnt通路在调控细胞增殖、分化和稳态维持中发挥核心作用，其关键效应分子β-catenin的稳定与核转位是通路激活的重要标志。本研究发现，DHA与EPA处理可显著上调Wnt通路关键基因（如Ccnd1、Ctnnb1和Myc）和蛋白（如cyclin D1、β-catenin、c-Myc）相对表达水平，并降低p-β-catenin相对表达水平，表明二者通过抑制β-catenin降解、促进其核转位，进而激活下游增殖相关基因转录。

然而，本研究仍存在一定局限性。虽然研究首先明确了单一成分（DHA、EPA）对肠道上皮细胞增殖的独立作用及最佳作用浓度与时间，然而二者常共存在于正常膳食结构中，其潜在的协同或拮抗效应需进一步探究。后续研究将设计不同浓度配比的混合干预实验，明确其复合干预的生物学效应及机制。此外，ω-3 PUFAs还可能通过PI3K/Akt、丝裂原活化蛋白激酶和核因子κB等多条信号通路发挥作用，这些通路与Wnt信号之间的交互调控网络值得深入解析。同时，本研究结论仍需通过使用Wnt通路特异性抑制剂或基因沉默技术进行功能获得/丧失实验作进一步验证，这将是本研究团队后续研究的重点方向。

综上所述，DHA和EPA在适当浓度与作用时间内可显著促进IEC-6细胞增殖，该效应经由Wnt/β-catenin通路介导。基于当前研究成果，后续研究将利用体外肠屏障模型或动物实验，进一步探究DHA/EPA对肠道屏障功能（如跨上皮电阻、紧密连接蛋白表达）和细胞分化的影响，明确复合干预的生物学效应及机制，阐明其精确的上游激活机制，以更全面地评估其应用价值。

本研究证实，DHA与EPA在特定条件下均能显著促进小肠上皮细胞IEC-6增殖，其最适条件分别为100 μmol/L DHA处理24 h与10 μmol/L DHA处理24 h。该促增殖效应具有浓度与时间依赖性，并经由激活Wnt/β-catenin信号通路实现，表现为关键增殖相关基因（如Ccnd1、Ctnnb1和Myc）和蛋白（如cyclin D1、β-catenin、c-Myc）相对表达上调。综上，本研究提示DHA与EPA可通过激活Wnt通路促进肠道上皮细胞增殖与修复，可为其在婴幼儿配方乳粉中的针对性添加与功能优化提供理论依据。

编辑：南伊（实习）；责编：刘莉