PBJ | 东北农业大学陈庆山团队利用CRISPR-Cas9技术创制高甘油二酯和高卵磷脂大豆新种质

研究背景

大豆（Glycine max (L.) Merr.）是全球最重要的植物油来源之一，广泛用于生物燃料合成以及人类和动物的消费。随着生活水平的提高，人们对食用油的营养价值和健康功能提出了更高的要求。

在大豆油的天然成分中，甘油二酯（Diacylglycerols, DAGs）虽然含量较少，但因其独特的酰基甘油结构和代谢特性，被视为一种重要的功能性食品成分。与传统的甘油三酯（TAGs，即普通脂肪）不同，膳食中的甘油二酯据报道能够维持能量消耗，并防止健康个体的体脂积累，具有“吃油不长肉”的潜在健康益处。

此外，大豆油还含有多种生物活性化合物，其中卵磷脂（Lecithin）尤为重要。大豆卵磷脂主要由磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）和磷脂酰肌醇（PI）组成，其中PC含量最高。卵磷脂在医药和食品工业中应用广泛，具有改善认知功能、增强免疫力和缓解更年期症状等多种潜在的健康益处。

为了满足最佳的营养需求和健康的饮食习惯，提高大豆种子油中甘油二酯和卵磷脂的含量具有重要的科学意义和商业价值。在高等植物中，TAG的合成主要通过肯尼迪途径（Kennedy pathway）中的核心酶——甘油二酯酰基转移酶（DGAT）进行调节。此外，磷脂：甘油二酯酰基转移酶（PDAT）也能在磷脂（如PC）的参与下催化TAG的合成。因此，通过代谢工程手段阻断TAG的合成途径，理论上可以导致其前体物质（DAG和PC）的积累。

论文概要

东北农业大学农学院的陈庆山教授、杨明亮副教授和胡振邦副教授团队在国际知名期刊 Plant Biotechnology Journal 发表了题为“Design of High-Diacylglycerol and Lecithin Soybean Seed Oil Using GmPDATs and GmDGATs Knockout via a CRISPR-Cas9 System”的论文。

该研究揭示了通过CRISPR/Cas9基因编辑系统同时敲除大豆中的 GmDGATs 和 GmPDATs 基因，能够显著阻断甘油三酯（TAG）的合成流，从而导致种子中甘油二酯（DAG）和卵磷脂（主要是PC）含量的显著提升。这项工作成功获得了一系列高DAG和高卵磷脂含量的大豆突变体株系，为培育高营养价值的功能性大豆新品种提供了重要的种质资源和技术路径。

主要研究结果

1. 关键基因的挖掘与功能验证

为了在大豆中精准调控油脂代谢，研究团队首先在大豆基因组中鉴定了相关的合成酶基因。

• PDAT基因家族： 基于与拟南芥 AtPDAT1/2 的序列同源性，研究人员在大豆基因组中鉴定出8个 PDAT 基因。通过表达分析，发现 GmPDAT1B、1D、2A 和 2B 在种子发育过程中表达量较高，因此被选为研究对象。
• DGAT基因家族： 在大豆基因组鉴定的三类DGAT中，DGAT1 家族基因（GmDGAT1A/B/C）被认为是油脂积累的重要调节因子。研究发现这三个基因在发育中的大豆种子中显著上调表达，与其它植物中 DGAT1 的表达模式一致。

亚细胞定位实验显示，GmDGAT1A/B/C 和 GmPDAT2A/B 特异性定位于内质网（ER），而 GmPDAT1B/D 则定位于叶绿体（图 1a）。为了验证这些基因的功能，研究人员将它们分别在TAG合成缺陷的酵母突变体中表达，结果显示所有测试基因均能恢复酵母合成TAG的能力，证实了它们在油脂合成中的功能活性。

2. CRISPR/Cas9介导的基因编辑突变体创制

基于上述功能验证，研究团队构建了一个包含三个单向导RNA（sgRNA）的CRISPR/Cas9载体，分别靶向 DGAT1A/B/C、PDAT1B/D 和 PDAT2A/B（图 1b）。

通过农杆菌介导的大豆（品种DN50）转化，研究人员获得了34个阳性T0代株系。在T1代中，通过测序鉴定了多种突变类型，包括碱基的插入和缺失，这些突变导致了移码翻译。最终，研究人员筛选出了8个具有不同突变组合的纯合突变体株系进行深入分析，例如 c6-6 (dgat1ab/pdat2ab)、c16-1 (pdat1d2b) 和 c23-1 (dgat1ab/pdat1b2a) 等（图 1c, 1d）。

3. 突变体种子油脂性状与显微结构的改变

对突变体种子的分析表明，GmDGATs 和/或 GmPDATs 的敲除导致了显著的表型变化：

• 含油量下降与蛋白含量上升： 与野生型（WT）相比，突变体种子的含油量显着降低（降幅从8.7%到33.2%不等），而蛋白含量则相应增加（增幅2.9%到11.4%）（图 1f）。这符合油脂和蛋白在大豆种子中通常呈负相关的规律。
• 油体变小： 扫描透射电子显微镜（STEM）观察显示，发育中的突变体子叶细胞内的油体（Oil Body, OB）尺寸明显小于野生型（图 1g, 1h），这与油脂积累减少的表型一致。
• 生长发育正常： 值得注意的是，尽管油脂代谢发生了巨大改变，但在野生型和突变体之间未观察到明显的可见发育或生长表型差异，且所有突变株系均保持了稳定的种子产量（表 S6）。

4. 脂质组学分析揭示DAG和卵磷脂的显著富集

这是本研究最核心的发现。研究人员利用电喷雾电离串联质谱（ESI-MS/MS）对成熟种子的脂质谱进行了详细分析（图 1i）：

• DAG和PC含量飙升： 所有突变体株系的DAG和PC（磷脂酰胆碱）含量均较野生型大幅提升。
• 表现最突出的株系是 c23-1（同时敲除了 dgat1ab 和 pdat1b2a），其 DAG含量增加了10.0倍，PC含量增加了7.56倍。
• 另一株系 c23-3（dgat1ab/pdat1bd）也表现出极高的提升，DAG和PC分别增加了8.7倍和7.32倍。
• 其他磷脂的同步提升： 除了PC，其他磷脂成分如PI（磷脂酰肌醇）、PS（磷脂酰丝氨酸）、PG和PE（磷脂酰乙醇胺）在所有突变体中也显著增加。其中PE的增幅尤为惊人，增加了8.90至10.93倍。
• TAG含量下降： 与含油量分析结果一致，突变体中的TAG含量呈现不同程度的下降趋势。
• 薄层层析（TLC）验证： TLC分析直观地展示了突变体种子油中DAG条带的显著增强，而野生型中的DAG条带则相对较弱（图 1j, 1k）。

5. 协同效应机制解析

研究团队提出了 GmDGATs 和 GmPDATs 调节DAG和磷脂积累的机理模型（图 1l）：

• DGAT途径阻断： 敲除 GmDGAT1A/B/C 阻断了经典的酰基辅酶A依赖性TAG合成途径的关键步骤，直接导致其底物DAG的积累。
• PDAT途径阻断： 敲除 GmPDAT1B/D/2A/B 抑制了涉及PC和其他磷脂的替代性TAG合成途径，从而导致PC基卵磷脂的增加。
• 协同增效： 最重要的发现是，同时敲除 DGATs 和 PDATs 会产生协同效应（Synergistic effect）。当两条合成TAG的路径同时被切断时（如 c23-1 株系），碳通量无法流向TAG，只能被迫通过更有效地方式转向DAG和PC的积累。这种双重阻断比单一突变更能显著改变脂质谱。

全文总结与展望

本研究成功利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，通过组合敲除大豆中的 GmDGATs 和 GmPDATs 基因，精细调控了种子的油脂代谢网络。研究结果表明，同时阻断TAG合成的两个主要途径（DGAT和PDAT途径），可以极大地促进健康油脂成分——甘油二酯（DAG）和生物活性成分——卵磷脂（尤其是PC）在种子中的积累。

具体而言，获得的优异突变体株系中DAG含量提高了10倍，PC含量提高了7.5倍以上。尽管这导致了总含油量的下降，但种子蛋白质含量的提升以及并未受损的农艺性状（如产量），使得这些新种质具有极高的应用潜力。

这项工作不仅证明了利用CRISPR/Cas9介导的代谢工程改良大豆营养品质的可行性，更为开发具有高附加值、不仅满足生物燃料需求更能满足人类健康饮食需求的功能性大豆油提供了宝贵的遗传资源。未来，这些高DAG、高卵磷脂的大豆油有望作为功能性食品原料，在预防肥胖、心血管健康及脑健康领域发挥重要作用。

研究团队与资助

本研究由东北农业大学农学院、智慧农场技术与系统全国重点实验室的团队完成。

• 第一作者： Ying Zhao
• 通讯作者： 陈庆山（Qingshan Chen）教授、杨明亮（Mingliang Yang）副教授、胡振邦（Zhenbang Hu）教授。
• 资助信息： 本研究得到了生物育种-国家科技重大专项 (2023ZD0403101) 以及国家自然科学基金 (32501888, U23A201783, 32272093) 的资助。

DOI链接

https://doi.org/10.1111/pbi.70383