PBJ | 中国农业大学陈其军团队利用GmRPS5启动子驱动CRISPR/LbCas12a高效创制大豆六重突变体

研究背景

大豆（Glycine max）是世界上最重要的植物蛋白和油料作物之一。随着基因编辑技术的发展，CRISPR/SpCas9 系统已成为大豆基因组编辑的主流工具。在目前已报道的大豆稳定转化研究中，绝大多数（约47%）使用的是 CaMV 35S 或 2×CaMV 35S 启动子来驱动 Cas 酶的表达。尽管也有研究使用了 GmUbi3、GmScreamM4（GmEF1A2）等植物内源启动子，但对于新兴的 CRISPR/Cas12a 系统，其在大豆中的启动子选择仍主要局限于传统的组成型启动子（如 eFMV-AtEF1A, CaMV 35S 等）。

与 Cas9 相比，LbCas12a（及其变体）在多基因编辑（Multiplex genome editing）方面具有独特优势，因为它能通过自身的 RNA 酶活性加工 CRISPR array，仅需较短的 crRNA 即可工作。研究团队此前已在拟南芥中证明，由 RPS5（核糖体蛋白 S5）启动子驱动的 ttLbUV2（一种耐低温、高活性的 LbCas12a 变体）具有极高的多基因编辑效率。鉴于多基因性状改良（如同时改变大豆的香味、豆腥味和生育期）在育种中的重要性，探索适合大豆的高效 LbCas12a 表达系统显得尤为迫切。

论文概要

近日，中国农业大学的 陈其军 教授团队在国际植物生物技术领域权威期刊 Plant Biotechnology Journal 发表了题为“GmRPS5 Promoter-Driven CRISPR/LbCas12a Efficiently Generates Soybean Sextuple Mutants”的研究论文。

该研究从大豆基因组中克隆并筛选了多个 GmRPS5 启动子，用于驱动高效的 LbCas12a 变体（ttLbUV2）。研究发现，GmRPS5-9 启动子表现最为优异，能够支持在 T0 代大豆植株中对6个目标基因进行极其高效的编辑，成功获得了六重突变体（Sextuple mutants）。该系统不仅编辑效率高，且突变能够稳定遗传至 T1 代，并成功在后代中获得了无转基因成分（Transgene-free）的纯合突变株系，这些植株表现出了预期的浓郁香味表型。该研究为大豆复杂性状的改良提供了一套强有力的多基因编辑工具箱。

主要研究结果

1. 启动子筛选与多基因编辑载体的构建

为了寻找在大豆中能高效驱动 LbCas12a 的启动子，研究团队从大豆品种“天隆1号”中克隆了4个 GmRPS5 基因的启动子，根据其在染色体上的位置分别命名为 RPS5-2、RPS5-9、RPS5-12 和 RPS5-13。作为对照，团队还使用了两个已知的高表达启动子 GmScreamM4 和 GmScreamM8（关联于 EF1A 基因）。

研究人员构建了含有不同启动子驱动 ttLbUV2（携带 D156R 和 E795L 突变及优化核定位信号）的 CRISPR/Cas12a 载体。为了测试多基因编辑能力，他们设计了针对6个重要农艺性状基因的 crRNA 阵列，目标基因包括：

• 香味相关基因：BADH1 和 BADH2（甜菜碱醛脱氢酶），突变后可产生浓郁香味。
• 风味相关基因：Lox1、Lox2 和 Lox3（脂氧合酶），突变后可减少大豆的豆腥味。
• 生育期基因：E1（主要成熟期基因），突变后降低光周期敏感性。

载体设计采用了 AtU6 或 GmU6 启动子来转录 crRNA 阵列，共构建了包含不同启动子组合的载体进行大豆遗传转化（图1a）。

2. GmRPS5-9 启动子展现出卓越的编辑效率

通过对获得的272株转基因大豆 T0 代植株进行分析，研究团队评估了不同启动子的编辑效率。

• 总体效率：所有6个测试的启动子均能有效驱动 LbCas12a 进行基因编辑。
• 最优表现：GmRPS5-9 和 GmScreamM4 的编辑效率最高。在 GmRPS5-9 驱动下，6基因同时发生纯合或双等位突变（Homozygous/Biallelic）的频率高达 21.2% (14/66)，而 GmScreamM4 为 22.9%。
• 嵌合率：GmRPS5-9 的嵌合突变频率（57.6%）高于 GmScreamM4（39.6%），表明其在体细胞中的活性非常高。
• 靶向偏好性低：数据表明，六重突变的基因型在所有突变类型中占比最高，说明该系统没有明显的靶向偏好，能均衡地切割所有目标位点（图1b, 1c）。

3. AtU6 与 GmU6 启动子在大豆中效率相当

在构建 crRNA 表达盒时，研究人员对比了拟南芥来源的 AtU6-26 启动子和大豆内源的 GmU6 启动子。通过对比不同载体组合（pM4a/b vs pM4c/d）在6个靶点上的编辑效率，统计分析显示两者之间没有显著差异（图1d）。这表明，常用的拟南芥 AtU6 启动子在大豆中依然是一个高效的 Pol III 启动子，能够有力支持多基因编辑体系的运作。

4. 突变的稳定遗传与表型验证

为了验证编辑系统的实用性，研究团队对 T0 代植株的后代（T1 代）进行了追踪。

• 遗传稳定性：源自 T0 代纯合或杂合突变株系的 T1 代植株，其突变位点均实现了稳定遗传。有趣的是，某些在 T0 代表现为嵌合（Chimeric）的突变，在 T1 代也成功分离出了纯合或双等位基因的六重突变体。
• 无转基因突变体：研究成功筛选到了不含 T-DNA 插入（Cas-free）的 T1 代纯合/双等位六重突变体。
• 性状改良验证：针对 BADH 基因突变带来的香味性状，研究人员检测了11株六重突变体叶片中的 2-乙酰基-1-吡咯啉 (2-AP) 含量。结果显示，所有突变体中的 2-AP 含量均显著高于野生型（图1e）。这意味着该系统成功创制了兼具香味、低豆腥味潜力且生育期改变的大豆新种质。
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全文总结与展望

本研究针对大豆多基因精密改良的需求，开发了一套基于 GmRPS5-9 启动子驱动 ttLbUV2 变体的高效 CRISPR/Cas12a 编辑系统。

该系统展现了以下核心优势：

1. 高活性的内源启动子：GmRPS5-9 在驱动 Cas 酶活性方面表现优异，足以媲美甚至在某些指标上超越了组成型强启动子 GmScreamM4。
2. 强大的多基因编辑能力：能够一步法实现6个基因的高效敲除，六重突变体的获得率超过20%。
3. 稳定的遗传转化：突变性状可稳定遗传，并能快速获得无转基因的改良后代。

这一研究成果丰富了大豆基因编辑的工具箱，特别是为涉及代谢通路改造（如风味物质合成）和复杂农艺性状聚合的育种工作提供了强有力的技术支撑。未来，利用 GmRPS5-9 启动子结合其他新型编辑器（如单碱基编辑器或引导编辑器），有望在大豆中实现更为精准和复杂的基因组修饰。

研究团队与资助

本论文的共同第一作者为中国农业大学的博士生 Xiangchao Kong、Kexin Fan以及 Cuiping Xin。

通讯作者为中国农业大学生物学院及作物功能基因组与分子育种中心的 陈其军（Qi-Jun Chen）教授。

本研究得到了生物育种重大项目（Biological Breeding-Major Projects）、国家重点研发计划（National Key Research and Development Program of China）以及农业科技重大项目的资助。

DOI链接

https://doi.org/10.1111/pbi.70588