中国林科院PMS速递:入侵林业害虫长林小蠹的现场基因诊断及其潜在应用

题目：On-site genetic diagnosis for the invasive pest Hylurgus ligniperda (Fabricius) and its possible application

期刊：Pest Management Science

影响因子及中科院分区：3.8/一区TOP

发表日期：2025年3月13日

DOI：10.1002/ps.8756

第一作者：李承锦

通讯作者：姚艳霞

作者单位：中国林科院、山东省林业保护与发展服务中心、北京林业大学

背景：非本地树皮甲虫的入侵几乎影响了全球所有地区的森林。长林小蠹 (Hylurgus ligniperda) 是一种全球性的入侵性树皮甲虫，隐蔽地危害松树健康并在世界范围内潜伏传播。长林小蠹的全球性发生给松原木或木质材料的贸易带来了挑战。早期识别长林小蠹对于实施适当的害虫管理策略至关重要。

结果：本研究建立了一种基于重组酶聚合酶扩增和侧向流动试纸条（RPA-LFD）的简单、高效且准确的长林小蠹鉴定方法。该方法可以将长林小蠹与其他物种区分开来，其灵敏度阈值为 10 fg/μL。随后，利用 RPA-LFD 测定法进行了野外应用测试，这是林业昆虫学中的首个野外应用案例。野外测试结果表明，RPA-LFD 结合粗 DNA 提取可以准确识别长林小蠹（鞘翅除外）。研究还调查了环境因素（温度、湿度和风）的影响。结果表明，仅风速 (P=0.003) 与 LFD 的显色显著相关，且与 LFD 检测线的颜色和密度呈负相关。

结论：应用这种基于野外的快速鉴定方法有助于消除入侵害虫识别滞后的障碍。实施 RPA-LFD 旨在为快速识别入侵昆虫提供一种可靠且高效的工具，从而实现及时干预和有效的管理策略。

（一）RPA-LFD 检测体系的建立

靶标基因: 选择线粒体 ND2 基因作为靶标，因其进化速度快，适合物种鉴定。

引物探针筛选: 设计了一对引物 (HLRPAF/HLRPAR) 和三条探针 (P1, P2, P3)。通过筛选发现，组合 P3/HLRPAF/HLRPAR 表现最佳，完全没有假阳性信号，被用于后续实验。

（二）特异性与灵敏度评估

特异性：对长林小蠹的 4 个地理种群以及 9 种非靶标物种（如纵坑切梢小蠹 Tomicus piniperda、红脂大小蠹 Dendroctonus valens 等）进行了测试。结果显示，仅长林小蠹样品呈阳性（显示两条红线），其他物种均为阴性，表明该方法特异性极高。

灵敏度：检测限低至 10 fg/µL 的质粒 DNA；即使在混合了其他物种 DNA（比例 1:10 或 1:20）的情况下，仍能准确检测出长林小蠹。

图3. RPA-LFD 检测的特异性和灵敏度。(A) RPA-LFD 检测的特异性。 (B) RPA-LFD 检测的灵敏度。 (C) 混合 DNA 样本的检测结果。PS/NST，阳性结果 (PS) 与测试样本数量 (NST) 之比；NGV，归一化灰度值；+，阳性结果；-，阴性结果。

（三）野外现场应用验证

野外流程: 研究在山东烟台牟平区的沿海防护林进行了现场测试。使用便携式恒温金属浴、锂电池组和简化的粗 DNA 提取试剂盒。

（粗 DNA 提取 (10 min, 40°C) →RPA 扩增 (10 min, 38°C) → LFD 显色 (3-5 min)。全过程约 31.5 ± 3.2 分钟）

检测样本: 测试了成虫、幼虫、蛹以及虫体残骸。

准确率: 与实验室 DNA 条形码测序结果对比，RPA-LFD 在野外对成功提取 DNA 的样本（幼虫、蛹、成虫体液）识别准确率达到 100%。（仅有的失败案例是来自昆虫鞘翅的样本，原因是无法从中提取出足够的粗 DNA）

图1.图 1. RPA-LFD 检测在野外的现场应用。(A) 长林小蠹的快速鉴定及其在野外的应用效果。 (B) RPA-LFD 检测野外应用地点的坐标。一些地点位置相近，在地图上可能重叠。 (C) 带有新鲜虫粪和明显羽化孔的目标原木（剥去树皮，用镊子小心采集昆虫样本）。 (D) 野外操作所需的设备和反应试剂。

（四）环境因素的影响

温度和湿度对结果无显著影响，但风速与 LFD 的显色强度呈显著负相关 (P=0.003)。风速过大可能会加速层析过程，导致检测线颜色变浅，建议野外操作时避风。

图4. 风速与 LFD 结果之间的相关性。

本研究成功建立了一种针对长林小蠹的 RPA-LFD 快速检测方法，具备高特异性和高灵敏度（10 fg/µL）。这是林业昆虫学领域首次报道 RPA-LFD 技术的野外实地应用。配合便携设备和粗 DNA 提取方法，可在 30 多分钟内完成“样本到结果”的诊断。野外测试证明了该方法对幼虫和成虫组织均有效（鞘翅除外），并指出风速是野外操作中需要控制的关键环境变量。该技术为海关口岸的快速检疫和林区入侵害虫的早期监测提供了强有力的工具，有助于及时阻断害虫传播 。