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PBJ | 安徽农业大学李晓玉团队揭示玉米双uORFs协同调控青贮玉米营养品质的分子机制

2026-08-15 15:26:13

近日，Plant Biotechnology Journal杂志在线发表了由安徽农业大学作物抗逆育种与减灾国家地方联合工程实验室李晓玉教授团队撰写的“Natural and CRISPR/Cas9 Editing Variations of Dual-uORFs Synergistically Increase the Nutritional Value of Silage Maize Feed”论文。研究团队通过对117个物种的224个GDP-L-半乳糖焦磷酸化酶（GGP）同源基因进行演化分析，在玉米中发现了两个功能协同的上游开放阅读框（uORFs），其中uORF1具有天然翻译增强型单倍型Hap2。在此基础上，结合CRISPR/Cas9基因编辑技术对高度保守的uORF2进行精准敲除，成功构建了“双uORF协同增效”的突破性育种材料。该策略有效解除了uORFs对主编码区（pORF）的翻译抑制，不仅激活了Vc合成途径，还诱导了氮代谢、磷平衡及细胞壁重塑相关基因的系统性转录重构；在保障产量稳定的前提下，协同提升了玉米的Vc、粗蛋白和磷含量，同时大幅降低了粗纤维水平。该研究巧妙利用“自然优异变异”与“基因编辑”双重策略，在保障玉米产量稳定的前提下，协同提升了青贮玉米的多种核心营养指标，为高品质营养育种提供了全新的分子调控机制与种质资源。

uORF是mRNA 5'非翻译区（5'UTR）中一类关键的顺式翻译调控元件，主要通过控制pORF的翻译效率来精细调控基因表达(Luo and Sachs, 1996; Mize and Morris, 2001; Morris and Geballe, 2000; Ruan et al., 1996; Zhong et al., 2023)。随着基因编辑技术的发展，针对uORF的定向改造已成为打破作物产量与品质互作权衡、实现精准分子育种的强有力策略(Xing et al., 2020; Xu et al., 2017; Yang et al., 2024; Zhang et al., 2018; Zhang et al., 2025)。GGP作为植物维生素C（Vc）合成途径的关键限速酶，其翻译水平的精准微调对调控Vc积累至关重要(Dowdle et al., 2007; Fenech et al., 2021)。此前研究主要聚焦于GGP单个保守uORF的调控作用(Li et al., 2018; Sang et al., 2025; Zhang et al., 2018)。然而，玉米GGP的5'UTR中是否存在更复杂的多uORF协同调控网络，以及能否利用天然优异uORF变异绕过这种翻译抑制，此前尚缺乏系统研究。安徽农业大学李晓玉教授团队在玉米GGP基因中鉴定出两个功能协同的uORFs，并挖掘到uORF1存在一种天然翻译增强型单倍型Hap2。团队在深入解析ZmGGP 5'UTR中双uORFs协同调控机制的基础上，进一步利用CRISPR/Cas9技术对高度保守的uORF2进行精准编辑，成功创制了“自然变异+精准编辑”双uORFs协同增效的优异育种材料。全文核心研究结果如下：

1.ZmGGP的5′UTR区域存在两个具有功能的uORFs

研究团队首先对117个物种中的224个GGP同源基因进行了系统发育与进化分析。结果表明，尽管单双子叶植物分属于两个不同的进化支系，但其5′UTR区域均保留了一个由非标准起始密码子ACG起始的保守uORF。值得注意的是，研究团队在玉米和高粱的GGP 5′UTR区域中，另外鉴定到了一个由标准起始密码子ATG起始的uORF。在玉米中，这两个uORF分别被命名为uORF1和uORF2（图1a）：两者共享同一个终止密码子TGA。为了阐明这两个uORF的具体生物学功能，研究人员利用定点突变技术，分别将uORF1的起始密码子（ATG突变成ATA）和uORF2的起始密码子（ACG突变成ACA）进行突变破坏，并在烟草叶片中开展了双萤光素酶报告基因瞬时表达实验（图1b）。结果显示，单独突变uORF1的ATG或uORF2的ACG起始密码子，均能显著提升下游pORF的相对荧光素酶活性，且并未对基因的转录水平产生显著影响（图1c-e）。以上结果表明这两个uORF均对下游pORF翻译具有负调控作用。

图1.ZmGGP 5′UTR中两个uORF的鉴定及功能表征

2.ZmGGP uORF1自然变异解除翻译抑制并显著提升玉米Vc含量

为了探究玉米进化过程中ZmGGP uORFs的自然变异及其生物学效应，研究团队利用包含479份玉米自交系的关联群体基因组数据进行了单倍型分析。结果表明，ZmGGP的uORF2序列高度保守，而uORF1存在丰富的多态性（包含3个SNP和1个Indel），可划分为6个主要单倍型。其中，Hap1和Hap2为群体中的两个主导单倍型：Hap1在-351bp位点携带ACC序列，而Hap2在该位点发生了1-bp碱基插入，形成ACCC序列（图2a,b）。研究人员在代表性自交系B73（Hap1）和KN5585（Hap2）中发现，KN5585中这1bp的插入破坏了原有uORF1，导致提前出现终止密码子，使原本长399 bp的uORF1截短至231 bp（图2c）。双萤光素酶报告基因实验证实，相比于来源于B73的全长uORF1B73，来源于KN5585的截短型uORF1KN5585驱动的荧光素酶活性显著升高，且二者在转录水平无显著差异（图2d–f）。这表明uORF1的序列截短有效减轻了其对下游pORF的翻译抑制。群体表型关联分析进一步验证了这一发现：携带Hap2（ACCC型）的玉米品种，其叶片中的Vc含量显著高于携带Hap1（ACC型）的品种（图2g）。该结果表明，ZmGGP uORF1的自然变异调控了翻译效率，驱动了玉米进化过程中Vc含量的表型多样性。

图2.ZmGGP uORF1中的自然变异与Vc含量相关

3.uORF1自然变异与uORF2编辑变异协同解除翻译抑制并显著提升Vc含量

uORF作为关键的顺式作用元件，通常通过竞争核糖体结合或阻碍下游重新起始，对pORF的翻译发挥“刹车”作用。利用CRISPR/Cas9技术靶向破坏uORF，能够解除这种翻译抑制，从而提高蛋白质表达水平（图3a）。鉴于ZmGGP的uORF2在自然群体中高保守，研究团队选择以携带优异uORF1变异的自交系KN5585（Hap2单倍型）为遗传背景，对uORF2进行了定向基因编辑。团队成功获得了6个代表性的Hap2编辑株系（Hap2 #1–#6），其中#1至 #4为不同长度的缺失（46-76 bp），#5为46 bp缺失加点突变，#6为60 bp缺失。Sanger测序确认无脱靶效应（图3b, 附S1,S2）。双荧光素酶实验表明，相比于未编辑的 KN5585，编辑株系 Hap2 #1–#4 展现出显著升高的相对荧光素酶活性，极大地缓解了翻译抑制（图3c,d）。为了探究“uORF1自然变异”与”uORF2靶向编辑“是否存在协同效应，研究团队在Hap1和Hap2两种背景下进行了对比实验：结果显示，在Hap2背景下的编辑株系（Hap2 #1-#3）产生的翻译激活效应显著强于对应的Hap1编辑系（Hap1 #1-#3）表明Hap2自然变异与uORF2编辑具有显著加性效应（图3e，f）。RT-qPCR和免疫印迹分析，结果表明ZmGGP转录本和蛋白水平均高于KN5585（图3g，h），叶片Vc含量也随之大幅提升（图3i）。这些结果表明，对高度保守的uORF2进行编辑可以调控下游pORF的翻译。最重要的是，uORF靶向编辑与自然变异相结合，可以在特定遗传背景下产生叠加协同效应。

图3.通过CRISPR/Cas9对ZmGGP uORF2进行靶向编辑，增强了下游pORF的翻译以及Vc的含量

4.ZmGGP uORF1的自然变异提升青贮玉米Vc含量与营养品质

为了探究ZmGGP基因uORF1区域自然变异对青贮玉米品质的调控效应，研究者对R2期（乳熟期）两种单倍型群体多个组织进行了Vc水平定量分析。结果表明，与Hap1单倍型相比，Hap2单倍型在叶片、茎秆和籽粒中的Vc积累方面均具有明显优势（图4a–c）。理化分析显示，Hap2单倍型可协同改善青贮玉米的多个综合品质性状：除了Vc水平显著提高外，Hap2还导致籽粒粗蛋白含量显著增加，且秸秆中的磷含量更高，同时秸秆粗纤维含量显著降低（图4d–f）。而在干物质、粗脂肪、粗灰分、酸性洗涤纤维（ADF）、中性洗涤纤维（NDF）及钙含量方面，uORF2编辑株系与对照KN5585之间均未检测到明显差异（附S3），表明该自然变异在增加饲料营养密度的同时改善了适口性与消化率。对40个主要商业青贮玉米品种的基因型鉴定结果显示，仅有13个品种携带Hap2单倍型，占比仅为32%（图4g），表明当前近70%的青贮品种缺乏这一优良等位基因，预示着通过分子育种进行遗传改良具有巨大潜力。为此，研究团队针对uORF1区域内的Indel多态性，成功开发出专一性分子标记。PCR验证证实，该标记在Hap2种质中可特异性扩增出 353-bp的目标条带，而在Hap1品种中无扩增信号（图4h）。上述结果明确证实，ZmGGP uORF1区域的Hap2单倍型及分子标记能够特异有效地应用于高品质青贮玉米优良等位基因的精准鉴定与分子育种创制。

图4.Hap2单倍型提升Vc含量与青贮营养品质及分子标记开发

5.自然变异与基因编辑相结合提升了青贮玉米的营养价值

为了系统评估ZmGGP uORF2靶向编辑在青贮玉米生产中的实际应用潜力，研究人员对Hap2-uorf2突变体在R2期的叶片、茎秆和青贮后地上部生物量中的Vc积累进行了定量（图5a）。在R2期的叶片中，与KN5585相比，Hap2 #1–#4的Vc含量分别提高了1.02倍、0.46倍、0.5倍和0.31倍（图5b）。在成熟茎秆中，Hap2 #2、#3和 #4的Vc含量分别增加了0.8倍、1.43倍和0.66倍；KN5585的Vc含量与Hap2 #1相当（图5c）。籽粒中Hap2 #1、#2、#3的Vc含量分别提升了1.61倍、0.92倍和0.31倍（图5d）。此外，在模拟农业生产实际进行30天的青贮发酵后，Hap2 #1、#3和 #4中的Vc含量仍比KN5585高出1.0–1.2倍（附S4）。营养品质方面，Hap2 #1的籽粒粗蛋白含量和秸秆磷含量均显著提升，秸秆粗纤维含量显著降低（图5e）。这些结果表明Hap2 #1在提升Vc生物合成的同时协同改善了多项关键营养指标。

图5.Hap2-uorf2突变体多组织Vc积累与青贮营养品质分析

6.Hap2 #1在保持产量稳定的同时促进营养生长

为了评估提升品质的uORF2编辑株系是否存在植株生长发育及籽粒产量的负面影响，研究者对R2期KN5585及uORF2编辑突变体的地上部生物量（鲜重和干重）、株高及茎粗等多项农艺性状进行了系统评估（图6a）。结果表明，在所有uORF2编辑株系中，Hap2 #1表现出最优良的表型，其地上部鲜重、干重、株高及茎粗均显著高于KN5585（图6b–e）。至关重要的是，Hap2 #1的单株产量和百粒重未发生显著下降，成功在协同增加生物量积累的同时保持了产量的稳定性（图6f–h）。这些结果进一步明确证实，Hap2 #1等位基因在品质强化与产量适应性之间达到了最佳平衡。

图6.Hap2-uorf2突变体的产量与农艺性状分析

7.转录组分析表明Hap2#1触发了广泛的转录重编程

为了阐明Hap2 #1优良农艺表型背后的分子机制，研究者对成熟叶片组织进行了转录组测序分析，共鉴定出3,694个差异表达基因（DEGs，2,085个上调，1,609个下调），PCA与层次聚类均显示Hap2 #1与对照KN5585存在显著转录分化（图7a, 附S7）。分析显示，编辑ZmGGP uORF2，不仅直接上调了Vc生物合成L-半乳糖途径的关键基因（ZmGMP2、ZmGGP和ZmGPP，图7e），更激活了植物生长与营养代谢相关的功能模块：GO/KEGG富集显示，细胞壁松弛与纤维素合成（expa1、cesa1）、氮代谢相关基因（nnr2、nii2）和氨基酸转运蛋白基因（aaap18、aaap57）也显著上调以及SPX–PHR磷稳态调控网络等基因差异化表达，分子层面上解释了Hap2 #1营养生长增强与生物量增加的原因（图7b, 附S8a）。相反，核糖体功能与内质网蛋白折叠通路被显著抑制（图7c-d），提示细胞翻译与蛋白加工机制发生了系统性重构，这种资源的重新分配可能降低了内源消耗，促进了营养向籽粒的转移。这些结果表明，uORF2编辑不仅激活了Vc生物合成通路，还触发了生长和营养代谢相关过程的协同转录重编程。

图7.Hap2#1成熟叶片的转录组分析

8.双uORF协同调控青贮玉米品质的工作模型

基于研究结果，团队提出调控模型（图8）：ZmGGP的uORF1天然变异（Hap2）与uORF2编辑协同解除翻译抑制，提升ZmGGP的翻译效率，促进Vc合成，同时Vc作为核心代谢节点介导氮、磷代谢和细胞壁合成通路的转录重编程，最终实现青贮玉米Vc含量提升、营养品质改善且产量稳定的优良表型。

图8.双uORF协同调控青贮玉米品质的工作模型

本研究首次在玉米GGP基因中鉴定出两个功能协同的uORFs，打破了此前报道的单个保守ACG-uORF的传统范式。团队巧妙融合“uORF1天然截短变异（Hap2）”与“uORF2精准基因编辑”双重策略，进一步解除了uORFs对下游pORF的翻译抑制。这一协同调控不仅激活了Vc合成，更诱导了氮代谢、磷平衡及细胞壁重塑的广泛转录重编程；在保障产量稳定的前提下，实现了Vc、粗蛋白、磷含量显著提升与粗纤维降解的多方面品质提升。该成果不仅拓展了多uORF翻译调控的理论认知，更重要的是，为破解作物品质与产量权衡难题提供了精准的编辑方式、高效的分子标记以及青贮玉米新种质。

安徽农业大学作物抗逆育种与减灾国家地方联合工程实验室周静博士，王席副教授为论文共同第一作者，李晓玉教授，程备久教授，李长生教授为该研究工作共同通讯作者。研究工作得到了安徽省重点研发计划和生物育种安徽省实验室项目的资助。

论文链接：

https://doi.org/10.1111/pbi.70731

References:

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