南京农业大学副教授以通讯作者在国际权威期刊发表研究成果

近日，南京农业大学白菜系统生物学实验室在New Phytologist杂志发表了题为“Establishment of an Efficient and PAM-Relaxed LbCas12a Genome Editing Tool in Plants”的研究论文。该研究通过在LbCas12a-RRV中引入三重突变（D535G/S551F/D665N）以及与T5核酸外切酶融合，生成了T5exo-PF-LbCas12a。该工程化系统识别的PAM序列从5′-VTTV-3′扩展至5′-NYHV-3′；在不结球白菜、番茄和水稻的非经典PAM位点均表现出高效的编辑活性。此外，它还能通过微同源介导的末端连接（MMEJ）途径在植物中成功介导大片段缺失。该研究扩大了Cas12a在植物中的靶向范围，并首次提供了Cas12介导的基于MMEJ的大片段缺失在植物中的证据。该工具集有助于功能基因组学和作物改良研究，且该方法易于推广至其他植物物种。南京农业大学园艺学院张昌伟副教授，侯喜林教授，中国农业科学院植物保护研究所李方方研究员和上海市农科院杨学东副研究员为该论文的共同通讯作者。南京农业大学王耀龙博士，徐欢欢博士，硕士生鲁文君和万志文博士为该论文的共同第一作者。

CRISPR-Cas系统已广泛应用于植物遗传改良。Cas12a作为II类V型核酸酶，具有T-rich PAM、仅需单crRNA、自加工crRNA阵列、产生交错末端等优于Cas9的独特特性，为多重基因编辑提供了简化平台。然而，目前Cas12a在植物中的应用仍局限于少数物种，且靶向范围受严格的TTTV PAM序列限制。尽管已有工程化改造提升效率和拓宽PAM，但植物中兼具高效率和广靶向范围的Cas12a系统仍有待开发。本研究以不结球白菜为主要对象，在前期建立的遗传转化体系基础上，筛选并工程化改造LbCas12a-RRV，构建T5exo-PF-LbCas12a系统，旨在建立一种高效且PAM松弛的植物基因组编辑工具，并验证其在多物种中的通用性。

为了在不结球白菜中部署CRISPR-Cas12系统，根据其优势特性选择了三种核酸酶—FnCas12a、LbCas12a-RRV和enAsCas12a。以八氢番茄红素脱氢酶（BcPDS）基因为靶标。在测试靶点中，FnCas12a和enAsCas12a均表现出可忽略的活性，前者仅在TTTC/TTTG位点显示极低编辑效率（1.96%–4.26%），而后者则完全无活性。与之形成鲜明对比的是，LbCas12a-RRV在TTTG和TTTC位点表现出高达87.83%–92.96%的编辑效率，即使在编辑难度较大的TTTA位点也保持有效活性（60.32%）。在使用LbCas12a-RRV核酸酶的转化实验中，叶片组织和再生芽表现出几乎完全白化的表型（图1）。

图1 LbCas12a-RRV在不结球白菜中表现出强大的基因组编辑能力

随后在LbCas12a-RRV中引入了三个突变（D535G/S551F/D665N），以生成Plant-Flex-LbCas12a（PF-LbCas12a）。将其与T5核酸外切酶融合，构建了T5exo-LbCas12a-RRV系统。为评估其编辑活性，我们在不结球白菜的BrPDS基因中设计了七个靶位点（TTAC、TCAG1、CCAC、TCAG2、TTA、TTC、TTG）。T5exo-PF-LbCas12a在VTTV位点的编辑效率为45.46%–84.81%，在NYHV位点的编辑效率为36.02%–40.78%，分别较PF-LbCas12a提升2–4倍和>20倍；在TTTV位点的效率为48.24%–76.76%，略低于T5exo-LbCas12a-RRV（84.10%–100%），但仍保持较高水平（图2）。

图2 通过LbCas12a-RRV进行蛋白质工程改造靶向不结球白菜中更松弛的PAM序列并进一步优化

利通T5exo-PF-LbCas12a在18个不同YHV PAM靶点进行测试，其中15个检测到编辑活性（83.3%），效率范围1.70%–78.99%。验证T5exo-PF-LbCas12a的植物普适性，我们以番茄（双子叶）和水稻（单子叶）为材料，在SlPDS和OsPDS中针对6个非经典PAM位点（CAG、CCG、TCC、CAC、CCC、CTC）进行编辑评估（图3-4）。结果表明，番茄在CAG、TCC、CCG、CTC位点检测到编辑活性（3.05%–62.82%），水稻在CAG、CCC、TCC、CCG、CTC位点表现稳定（6.23%–77.04%）。综上，T5exo-PF-LbCas12a在单子叶和双子叶作物中均保持稳定编辑活性，证实其广泛植物适用性，可有效靶向植物基因组中5′-NYHV-3′位点，显著放宽PAM限制。

图3 T5exo-PF-LbCas12a系统在不结球白菜中对18个5'-YHV-3' PAM位点的编辑活性

图4 T5exo-PF-LbCas12a在水稻和番茄中对YHV PAM位点的编辑活性测试

大片段基因删除对于创制完全功能缺失突变体至关重要。传统上，片段删除主要依赖NHEJ途径，而微同源介导的末端连接（MMEJ）是另一种DNA修复机制。利用T5exo-PF-LbCas12a，在白菜Brnym1基因（Bra013656）上设计了3组MMEJ靶点，成功在不结球白菜中实现了Cas12a介导的MMEJ大片段删除，并创制了不结球白菜持绿新种质（图5）。

图5 通过T5exo-PF-LbCas12a介导的微同源末端连接（MMEJ）辅助精准大片段删除，创制不结球白菜持绿种质

通过在不结球白菜中的逐步优化，本研究开发了高效且PAM松弛的T5exo-PF-LbCas12a基因编辑系统。该系统在单子叶模式植物水稻和双子叶模式植物番茄中均表现出稳定的编辑活性，证实了其跨谱系适用性。此外，该系统在原始宿主中成功实现了持绿种质的创制以及MMEJ介导的精准大片段删除。这些发现确立了T5exo-PF-LbCas12a作为适用于多种植物基因组编辑的通用平台，为功能基因组学研究和作物遗传改良提供了有力工具。

文章链接：

https://nph.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/nph.71498