[精读]PBJ || 安徽农业大学团队:双uORF天然变异+CRISPR编辑协同增效,成功创制出高Vc、高蛋白优异种质,破解玉米产量-品质权衡难题

2ZmGGP基因5'UTR存在两个功能性uORF

此前研究已证实，GGP 基因 5'UTR 通常包含一个高度保守、以非经典 ACG 为起始密码子的 uORF。本研究对 117 个物种的 224 条 GGP 同源序列分析发现：尽管单子叶与双子叶植物形成两个独立进化分支，但二者 5'UTR 均高度保留了该 ACG 起始型 uORF 结构。

除此之外，研究在玉米与高粱的 GGP 5'UTR 中，进一步鉴定出第二个以经典 ATG 为起始密码子的 uORF。在玉米中，两个 uORF 分别命名为uORF1与uORF2：

• uORF1 以 ATG 起始，全长 399 bp，编码 133 个氨基酸的多肽；
• uORF2 以非经典 ACG 起始，全长 177 bp，编码 59 个氨基酸的多肽；
• 两个 uORF 共享同一个终止密码子 TGA。

为阐明两个 uORF 的功能，研究通过定点突变分别破坏其起始密码子：uORF1 的 ATG 突变为 ATA，uORF2 的 ACG 突变为 ACA。将两种突变型 5'UTR 分别融合萤火虫荧光素酶（FLUC）报告基因，以海肾荧光素酶（RLUC）为内参，在本氏烟叶片中瞬时表达。

结果显示：两种起始密码子突变均显著提升 FLUC/RLUC 相对活性，但对基因转录水平无显著影响。这表明ZmGGP 5'UTR 中的两个 uORF 均作为负调控因子，抑制下游主 ORF 的翻译。

图 1 ZmGGP 5'UTR 中两个uORF的鉴定与功能表征

图注翻译：(a) 代表性植物物种 GGP 5'UTR 的系统发育分析与序列比对。保守的非经典起始密码子（ACG）与单子叶植物特有的经典起始密码子（ATG）已高亮标注。(b) 双荧光素酶报告载体示意图（未按比例绘制）。野生型 ZmGGP 5'UTR 及其突变体（uATA-ACG 与 uATG-ACA）融合至 FLUC 报告基因上游。(c, d, e) ZmGGP uORF 中 uATA-ACG 与 uATG-ACA 突变对 FLUC/RLUC 相对活性（c, d）与 mRNA 相对水平（e）的影响。荧光素酶活性与 mRNA 丰度分别通过双荧光素酶报告实验（DLRA）与 RT-qPCR 测定。数据以平均值 ± 标准差表示（n=4）；p 值通过双尾 Student's t 检验计算；「ns」表示无显著差异。

2.2 ZmGGP uORF1的天然变异激活下游pORF翻译，提升Vc含量

为探究玉米驯化过程中 uORF 变异的生物学效应，研究对 479 份玉米关联群体进行单倍型分析。结果显示：uORF1 存在 3 个单核苷酸多态性（SNP）与 1 个插入缺失（Indel），共形成 6 种主要单倍型；而 uORF2 序列高度保守，几乎无变异。

在所有单倍型中，Hap1与Hap2占比最高，二者差异位于 - 351 bp 位点：Hap1为ACC序列，Hap2 在此处有1个碱基插入（ACCC）。

研究选取代表性自交系 B73（Hap1）与KN5585（Hap2）深入验证。序列比对发现：B73的 uORF1 全长 399 bp，而 KN5585 中的 1 bp 插入引入了提前终止密码子，使 uORF1 截短为仅 231 bp。

双荧光素酶报告实验表明：与 uORF1^B73 相比，uORF1^KN5585 显著提升 FLUC 活性，但转录丰度无显著差异。这说明uORF1 的截短解除了翻译抑制，增强了 ZmGGP 主 ORF 的下游翻译。

群体水平分析进一步验证：携带 Hap2（ACCC 型）的玉米品种，叶片 Vc 含量显著高于 Hap1（ACC 型）品种。上述结果共同表明，ZmGGP uORF1 的天然变异通过调控翻译效率，参与了玉米进化过程中 Vc 含量的表型分化。

图2 ZmGGP uORF1天然变异与Vc含量相关

图注翻译：(a) ZmGGP uORF1 的单倍型分析。图中标注了多态性核苷酸、序列变异及对应位置（未按比例绘制）。Poi：位点；Hap：单倍型。(b) Hap1 与 Hap2 中 Indel 位点的测序峰图。红色框 / 文字高亮显示 Hap2 相对于 Hap1 的单碱基插入变异（ACC→ACCC）。(c) 玉米自交系 B73 与 KN5585 的 ZmGGP uORF1 序列比对。(d) 双荧光素酶报告实验载体示意图（未按比例绘制）。将 B73 与 KN5585 来源的 ZmGGP 5'UTR 分别克隆至 FLUC 上游。(e-f) B73 型（Hap^B73）与 KN5585 型（Hap2^KN5585）ZmGGP uORF1 对 FLUC/RLUC 相对活性（e）与 mRNA 相对水平（f）的影响，分别通过 DLRA 与 RT-qPCR 定量。数据以平均值 ± 标准差表示（n=4）。(g) V6 时期 Hap1 与 Hap2 型玉米品种的叶片 Vc 含量。数据以平均值 ± 标准差表示（n=30）。

2.3 uORF1天然变异与uORF2编辑突变协同增效，大幅提升下游翻译与 Vc 含量

作为核心顺式调控元件，uORF主要通过竞争核糖体结合、或抑制核糖体在下游pORF的重新起始，抑制基因翻译。因此，利用 CRISPR/Cas9 定向破坏 uORF，是解除翻译抑制、提高蛋白表达的有效策略。

鉴于ZmGGP uORF2在天然玉米群体中高度保守，研究以携带 Hap2 单倍型的 KN5585 为遗传背景，对uORF2进行定向编辑，创制高Vc玉米株系。通过CRISPR/Cas9，共获得6个代表性Hap2等位变异体：

• Hap2 #1~#4：携带不同长度的缺失（46~76 bp）；
• Hap2 #5：46 bp 缺失伴随 1 个点突变；
• Hap2 #6：携带 60 bp 缺失。

经 Sanger 测序脱靶分析确认，Hap2 #1~#6 均为 ZmGGP uORF2 的敲除突变体，无脱靶效应。

双荧光素酶报告实验显示：与 KN5585 相比，Hap2 #1~#4 显著提升 FLUC/RLUC 相对活性，而 Hap2 #5 与 #6 的效应无统计学差异。

为验证 uORF1 天然变异（Hap2）与 uORF2 定向编辑是否存在加性效应，研究对比了 Hap1 与 Hap2 背景下的编辑效果。结果表明：

• 天然 Hap2 变异（KN5585）本身已具备翻译增强效应；
• 在 Hap1 背景下编辑 uORF2（Hap1 #1~#3）可产生更强的翻译激活；
• Hap2 背景下的编辑株系（Hap2 #1~#3），整体翻译增强效应显著高于对应 Hap1 背景的编辑株系
  ，证明二者具有协同加性效应。

研究进一步对翻译激活效应最显著的 4 个编辑株系（Hap2 #1~#4）进行分子验证：RT-qPCR 与免疫印迹分析证实，这些株系的 ZmGGP 转录水平与蛋白丰度均高于 KN5585。与之对应，4 个编辑株系的叶片 Vc 含量均显著升高。

上述结果表明：对保守 uORF2 的编辑可精准调控下游 pORF 翻译；更重要的是，uORF 编辑与天然变异的组合，可在特定等位背景下产生叠加的正向效应。

图3 CRISPR/Cas9 定向编辑 ZmGGP uORF2 增强下游 pORF 翻译与 Vc 含量

图注翻译：(a) CRISPR/Cas9 介导的 uORF 破坏增强下游 pORF 翻译效率的机制示意图（未按比例绘制）。(b) KN5585 株系中 ZmGGP uORF2 基因的 CRISPR/Cas9 诱导突变。sgRNA 靶向 ZmGGP uORF2 内约 80 bp 区域。橙色箭头指示 sgRNA 位置，蓝色框代表外显子区域。(c) 双荧光素酶报告载体示意图（未按比例绘制）。将 KN5585 与 Hap2-uorf2 突变体（Hap2 #1~6）的 5'UTR 序列克隆至 FLUC 上游。(d) 本氏烟叶片代表性荧光成像，及 Hap2 #1~6 突变体的 FLUC/RLUC 相对活性。(e) Hap1 #1~3 与 Hap2 #1~3 载体示意图，以 KN5585 为对照。(f) 本氏烟叶片代表性荧光成像，及 Hap2 #1~3 与 Hap1 #1~3 的 FLUC/RLUC 相对活性。(g) KN5585 与 Hap2 #1~4 突变体叶片中 ZmGGP 的相对表达量（RT-qPCR）。数据以平均值 ± 标准差表示（n=4）；统计显著性通过双尾 Student's t 检验，** p<0.01，*** p<0.001。(h) ZmGGP 蛋白免疫印迹分析，ZmGAPDH 为内参。(i) V6 时期 KN5585 及其 Hap2-uorf2 突变体的叶片 Vc 含量。数据以平均值 ± 标准差表示（n=3）；柱上方不同字母表示经单因素 ANOVA 与 Tukey's HSD 检验存在显著差异。

2.4 uORF1 天然变异提升青贮玉米 Vc 含量与营养品质

研究测定了R2期（乳熟中期）两种单倍型群体不同组织的Vc水平。结果显示：与 Hap1 相比，Hap2 单倍型在叶片、茎秆、籽粒中均具有显著的Vc积累优势。

进一步评估天然变异对青贮综合营养品质的影响发现：除Vc升高外，Hap2 还协同改良了多项品质性状 ——籽粒粗蛋白含量、秸秆磷含量显著提升，同时秸秆粗纤维含量显著降低。在干物质、粗脂肪、粗灰分、酸性洗涤纤维（ADF）、中性洗涤纤维（NDF）、钙含量等指标上，二者无明显差异。

这表明，Hap2单倍型提升了饲料营养密度，同时改善了青贮的适口性与消化率。

为评估 Hap2 单倍型在当前玉米生产中的育种潜力，研究对 40 个主流商业青贮玉米品种进行基因分型。结果显示：仅 13 个品种携带 Hap2 单倍型，其余 27 个均为非 Hap2 型，占比仅 32%。这意味着近 70% 的现有主栽品种缺乏这一优异等位基因，通过分子育种进行遗传改良的空间巨大。

为实现快速高效的分子选择，研究针对 uORF1 区的 Indel 多态性开发了分子标记。PCR 验证表明：该标记可在 Hap2 材料中特异性扩增出 353 bp 的目标片段，而 Hap1 品种无扩增条带，可用于优异 ZmGGP 等位基因的精准鉴定。

图4 ZmGGP uORF1 的 Hap2 单倍型显著提升 Vc 含量，改善玉米青贮营养品质

图注翻译：(a-c) R2 时期 Hap1 与 Hap2 单倍型在不同组织的 Vc 含量比较，分别为叶片 (a)、茎秆 (b)、籽粒 (c)。(d-f) Hap1 与 Hap2 单倍型的青贮玉米秸秆与鲜籽粒营养指标分析，包括磷含量 (d)、粗蛋白含量 (e)、粗纤维含量 (f)。数据以平均值 ± 标准差表示（n=30）。(g) 市售主流青贮玉米品种的基因分型分析。(h) ZmGGP Hap2 单倍型诊断分子标记的开发与验证。基于 uORF1 区 Indel 多态性进行 PCR 基因分型：Hap2 材料可特异性扩增出 353 bp 目标片段，Hap1 品种无扩增产物。M：DNA 分子量标记；第 2~7 泳道：Hap1 品种；第 8~13 泳道：Hap2 品种。

2.5 天然变异 + 基因编辑组合策略，全面提升玉米青贮营养价值

为系统评估 uORF2 定向编辑在青贮玉米生产中的实际应用潜力，研究测定了 Hap2-uorf2 突变体多组织的 Vc 积累，包括 R2 期叶片、秸秆，以及青贮加工后的地上部生物量。

结果显示：

• 叶片
  ：R2 期 Hap2 #1~#4 的 Vc 含量较 KN5585 分别提升 1.02、0.46、0.56、0.31 倍；
• 茎秆
  ：Hap2 #2、#3、#4 的 Vc 含量分别提升 0.8、1.43、0.66 倍，Hap2 #1 与对照相当；
• 籽粒
  ：提升效应尤为显著，Hap2 #1、#2、#3 的 Vc 含量分别提升 1.35、0.73、0.65 倍，浓度达 15.9~22.7 mg/100g 鲜重；Hap2 #4 提升 0.5 倍。

在模拟农业生产条件下青贮发酵 30 天后，Hap2 #1、#3、#4 的 Vc 含量仍比 KN5585 高 1.0~1.2 倍，达 32~35 mg/100g 鲜重。这说明 Hap2-uorf2 突变不仅提升了植株体内的 Vc 积累，还改善了青贮加工过程中的营养保留率。

进一步分析秸秆与籽粒的多项营养参数发现：Hap2 #1 在维持高 Vc 水平的同时，籽粒粗蛋白、秸秆磷含量显著提升，秸秆粗纤维含量显著下降；Hap2 #3 的秸秆磷含量也显著高于对照。其余常规营养指标（干物质、粗脂肪、粗灰分、ADF、NDF、钙等）在编辑株系与 KN5585 间无明显变化。

上述结果表明，Hap2 #1 株系在增强玉米 Vc 生物合成的同时，协同提升了关键营养性状，凸显了 uORF2 定向编辑在培育高营养价值青贮玉米品种中的巨大潜力。

图5 ZmGGP uORF2突变提升Vc 含量，改善青贮营养品质

图注翻译：(a) 青贮制备流程示意图。授粉后 30 天收获整株玉米（带果穗），切碎后发酵制成青贮。(b-d) R2 时期 KN5585 与 Hap2-uorf2 突变体的叶片 (b)、茎秆 (c)、籽粒 (d) Vc 含量。(e) Hap2 #1、#3、#4 与 KN5585 相比，青贮玉米秸秆与鲜籽粒的营养指标分析，包括磷、粗蛋白、粗纤维含量。数据以平均值 ± 标准差表示（n=4）。

2.6 优异株系Hap2#1促进营养生长，同时维持产量稳定

为评估「品质改良型」uORF2 编辑是否对植株发育与籽粒产量产生负面影响，研究在 R2 期对 KN5585 及其突变体的农艺性状进行系统测定，包括地上部生物量（鲜重、干重）、株高、茎粗等。

在所有基因编辑株系中，Hap2 #1 表现最优：其地上部鲜重、干重、株高、茎粗均高于 KN5585，说明该变异不仅未损害生长发育，反而表现出明显的促生长效应。更关键的是，Hap2 #1 的单株产量与百粒重未发生显著下降，成功在协同提升生物量积累的同时，维持了产量稳定性。

与之形成鲜明对比的是：Hap2 #2 与 #3 表现出严重的生长迟缓与生物量损失，产量与粒重显著降低；Hap2 #4 的生长指标与野生型相当，但产量性状仍呈下降趋势。籽粒表型分析显示，所有编辑突变体的粒长、粒宽与 KN5585 均无肉眼可见差异。

综上，Hap2 #1 等位基因实现了高 Vc 生物强化与农艺适应性之间的最优平衡。这一结果也警示：Vc 水平的稳态调控对植物正常营养生长与代谢稳定至关重要；利用 uORF 进行分子设计育种时，必须综合评估营养发育、产量表现与品质性状，避免代谢失衡引发的负面权衡。

图 6 Hap2-uorf2 突变体的产量与农艺性状分析

图注翻译：(a) KN5585 与 Hap2-uorf2 突变体的植株形态。标尺 = 2 cm。(b-e) 生物量相关性状分析，分别为地上部鲜重 (b)、地上部干重 (c)、茎粗 (d)、株高 (e)。(f) KN5585 与突变体的籽粒表型比较。(g-h) 植株百粒重 (g) 与单株籽粒产量 (h) 统计分析。数据以平均值 ± 标准差表示（n≥10）。

2.7 转录组解析 Hap2 #1 的全局转录重编程机制

为阐明 Hap2 #1 多样表型变化的分子机制，研究对成熟叶片组织进行 RNA-seq 分析。差异表达分析共鉴定出 3694 个差异表达基因（DEG），其中 2085 个上调，1609 个下调。主成分分析与层次聚类均显示，Hap2 #1 与对照 KN5585 的转录谱清晰分离，且生物学重复一致性良好。

（1）Vc 生物合成途径整体激活

研究首先考察 L - 半乳糖途径的 Vc 生物合成相关基因。与 Hap2 #1 中 ZmGGP 表达升高、Vc 积累增加的表型一致，ZmGMP2、ZmGGP、ZmGPP等多个途径关键基因均显著上调，表明 uORF2 的破坏引发了 Vc 生物合成途径的整体激活。

（2）生长与营养代谢通路协同重编程

除 Vc 合成途径外，转录组变化主要富集于植物生长与营养代谢相关功能模块：

• 上调基因
  ：GO 富集显著富集于纤维素合酶活性、细胞壁组织功能；细胞壁松弛与纤维素合成关键基因（如expa1、cesa1）显著上调，与 Hap2 #1 营养生长增强、生物量积累增加的表型吻合。同时，氮代谢（nnr2、nii2）与氨基酸转运（aaap18、aaap57）相关基因显著上调，提示氮同化过程发生协同调整；调控磷稳态的 SPX-PHR 网络相关基因也发生差异表达。
• 下调基因
  ：GO 富集显著富集于核糖体相关功能与蛋白质折叠过程；KEGG 通路分析显示，「核糖体」「内质网蛋白质加工」通路显著下调，提示细胞翻译与蛋白质加工机器发生系统性重塑，可能有助于减少内源资源消耗，使更多氨基酸分配至籽粒发育。

总体而言，ZmGGP uORF 的破坏增强了 Vc 生物合成途径的转录活性，同时伴随多个生长与营养代谢过程的协同转录重编程。这提示Vc 可能作为关键代谢节点，将 uORF 调控与广泛的转录、表型变化关联起来。

图7 Hap2 #1突变体玉米叶片的转录组分析

图注翻译：(a) KN5585 与 Hap2 #1 成熟叶片差异基因的层次聚类热图，显示两种基因型截然不同的转录谱。色阶代表 Z-score 标准化的表达值。(b-c) 上调 (b) 与下调 (c) 差异基因的 GO 富集分析。柱高代表基因数量，颜色梯度代表富集显著性。(d) 上调与下调差异基因的 KEGG 通路富集分析。气泡大小代表基因数量，颜色深浅代表富集显著性（p 值）。(e) Vc 生物合成 L - 半乳糖途径相关基因的表达谱。热图显示 KN5585 与 Hap2 #1 之间关键基因（ZmGMP2、ZmGGP (vtc2)、ZmGPP (vtc4)）的差异表达（Z-score）。所有基因均依据 MaizeGDB 数据库注释。