研究背景
核桃炭疽病（由胶孢炭疽菌 Colletotrichum gloeosporioides 引起）是核桃产业中最具破坏性的病害之一，常导致30%-50%的产量损失。植物进化出复杂的免疫系统来抵御病原体侵害，其中钙离子（Ca²⁺）信号作为核心的第二信使，在植物先天免疫响应中起着至关重要的作用。钙依赖性蛋白激酶（CDPKs/CPKs）是植物特有的钙感知蛋白，能够整合钙信号并将其中继给下游底物，如转录因子、代谢酶和离子通道，从而触发防御反应。然而，在核桃等木本植物中，CDPK如何介导钙信号传导以应对炭疽病感染的精确分子机制仍有待深入挖掘。
论文概要
山东农业大学林学院的房鸿成副教授和杨克强教授团队在植物学顶级期刊《Plant Physiology》发表了题为“JrCDPK13L-mediated phosphorylation of JrERF113L promotes walnut resistance to Colletotrichum gloeosporioides”的论文。该研究揭示了一个由 JrCDPK13L-JrERF113L-JrPR5L 组成的信号模块，通过磷酸化修饰增强转录因子的稳定性和活性，从而显著提升核桃对炭疽病的抗性。
主要研究结果介绍
JrCDPK13L 响应炭疽菌感染并受 Ca²⁺ 激活
研究人员首先对比了抗病核桃品种（L423）和感病品种（L37）在炭疽菌侵染后的生理响应。非损伤微测技术（NMT）监测显示，抗病品种侵染位点的自由 Ca²⁺ 流速显著高于感病品种（图1A）。转录组分析进一步筛选出12个 CDPK 基因，其中 JrCDPK13L 在抗病品种中表达量最高且诱导最显著（图1B, C）。序列分析发现 JrCDPK13L 拥有完整的 EF-hand 结构，体外激酶实验证明其具有 Ca²⁺ 依赖性的自磷酸化活性（图1E），表明其作为一个钙传感器参与了核桃的免疫反应。
JrCDPK13L 正向调控核桃抗炭疽病
为验证 JrCDPK13L 的生物学功能，研究团队通过瞬时过表达和病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术对核桃叶片进行评估。结果显示，过表达 JrCDPK13L 的叶片在接种炭疽菌后，病斑直径明显减小，ROS 积累量和防御相关基因（如 JrPRs）的表达量显著增加（图2A-C, G）。相反，沉默该基因则导致核桃叶片对炭疽菌更加敏感，病斑直径扩大，ROS 产生受阻（图2D-F, H）。这证明 JrCDPK13L 是核桃抗炭疽病的积极调控因子。
JrCDPK13L 与乙烯响应因子 JrERF113L 互作
为了寻找 JrCDPK13L 的下游靶蛋白，研究人员通过蛋白互作网络预测和实验验证，鉴定出 VII 组乙烯响应因子 JrERF113L。通过酵母双杂交（Y2H）、荧光素酶互补实验（LCA）、双分子荧光互补（BiFC）、Pull-down 以及共免疫沉淀（Co-IP）等多种生物化学手段，一致确认了 JrCDPK13L 与 JrERF113L 在体内和体外均存在物理互作，且互作位点位于细胞核（图3）。
JrERF113L 直接激活防御基因 JrPR5L 的表达
研究进一步证实，JrERF113L 同样正向调控核桃对炭疽病的抗性（图4）。通过酵母单杂交（Y1H）、电泳迁移率实验（EMSA）以及双荧光素酶报告系统实验，发现 JrERF113L 能够特异性结合防御基因 JrPR5L 启动子上的 GCCGAC 基序（图5）。这表明 JrERF113L 通过直接激活 JrPR5L 的转录来增强核桃的病害抵御能力。
JrCDPK13L 磷酸化 JrERF113L 增强其稳定性
机制研究发现，JrCDPK13L 能够磷酸化 JrERF113L（图6A, B）。通过位点预测和突变分析，研究人员确定了 Ser271 和 Ser280 为 JrCDPK13L 磷酸化 JrERF113L 的关键残基。体外无细胞降解实验显示，磷酸化作用显著延缓了 JrERF113L 蛋白的降解过程；而模拟磷酸化突变体（JrERF113L-S271D/S280D）比非磷酸化形式（S271A/S280A）表现出更强的蛋白稳定性（图6D, E）。
此外，磷酸化不仅增强了 JrERF113L 对 JrPR5L 启动子的结合亲和力，还进一步提升了其转录激活活性（图6F, G）。在核桃叶片中回补实验证明，磷酸化形式的 JrERF113L 赋予了植株更强的炭疽病抗性（图6H, I）。
全文总结与展望
该研究提出了一套清晰的核桃抗炭疽病表观及信号转导通路图（图7）：当胶孢炭疽菌侵染核桃时，诱导细胞外 Ca²⁺ 流入胞内，产生的钙信号激活了 JrCDPK13L。一方面，JrCDPK13L 的转录被诱导；另一方面，活化的 JrCDPK13L 在胞核内磷酸化转录因子 JrERF113L（位于 Ser271/280 位点）。这种磷酸化修饰起到“保护罩”作用，防止 JrERF113L 蛋白被降解，并增强其对防御基因 JrPR5L 的转录激活，最终促进 ROS 爆发和病程相关蛋白积累，大幅度提高核桃对炭疽病的抗性。
这一研究成果不仅丰富了木本植物抗病免疫的分子理论，也为核桃抗病品种的分子育种和遗传改良提供了宝贵的基因资源和理论基础。未来的研究可进一步探索 JrERF113L 是否还参与调节其他防御通路，以及该模块在应对其他生物或非生物胁迫中的通用性。
研究团队与资助
该研究由山东农业大学林学院核桃科研团队完成。论文的第一作者为硕士研究生Haiyi Yu和Yuhui Dong（共同第一作者），通讯作者为房鸿成副教授和杨克强教授。该研究得到了国家自然科学基金（32572104, 32371919）和山东省重点研发计划（2024LZGC025）的资助。
DOI链接
https://doi.org/10.1093/plphys/kiag494
