《乳业科学与技术》:中国农业大学毛学英教授、国家食品安全风险评估中心王君研究员等:乳蛋白改性技术及其对功能特性影响研究进展

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乳蛋白酶法改性

酶法改性依靠酶与蛋白质之间的特异性相互作用，可促使蛋白质发生水解或交联，改变其分子结构，进而提升热稳定性、乳化性、起泡性及流变特性等功能性质。该改性方法具有反应专一性强、作用条件温和、应用安全性高等突出优势。

乳蛋白功能特性的优化取决于蛋白酶对肽链水解位点的极强专一性。不同蛋白酶因其切割特异性的差异，通过调控多肽链降解及分子间重连过程，从而决定水解产物的分子质量分布与肽段组成，实现对乳蛋白功能特性的改良。因此，针对目标功能需求选择特定的蛋白酶类型，是酶水解改性工艺的关键调控环节。蛋白酶的特点及其对乳蛋白的改性作用如表1所示。

1.1.1 碱性蛋白酶对乳蛋白功能特性的改善作用

碱性蛋白酶水解效率突出，能较大程度地水解β-乳球蛋白，显著破坏抗原结合位点，同时使α-乳白蛋白各表位均被酶解，是制备低敏乳制品的良好选择。此外，该酶能显著改善乳蛋白的加工特性，显著提升酪蛋白酸钠的溶解度，并增强其乳化性能。

在生物活性方面，碱性蛋白酶制备的乳蛋白水解物具有多种益处。碱性蛋白酶处理牛乳和羊乳蛋白后得到的活性肽具有较强的ACE抑制作用，其中山羊乳水解产物的ACE抑制率高达88.5%，显著高于胰蛋白酶和木瓜蛋白酶等其他处理组。此外，碱性蛋白酶产生的酪蛋白肽对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制效果显著。针对牦牛乳乳清蛋白的研究发现，碱性蛋白酶在62 ℃、pH 8.0下可获得高含量活性肽，其＜1 kDa的超滤组分在清除2,2’-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（ABTS）阳离子自由基和抑制黄嘌呤氧化酶方面表现较优。这主要归因于碱性蛋白酶能高效切割疏水性氨基酸苯丙氨酸、酪氨酸和亮氨酸的羧基端肽键，从而释放出具有高生物活性的肽段。然而，该酶水解程度较高，若控制不当易产生苦味肽并削弱凝胶能力，因此在实际应用中需通过控制水解度以平衡功能改善与感官品质。

1.1.2 中性蛋白酶对乳蛋白功能特性的改善作用

中性蛋白酶主要作用于疏水性大分子氨基酸羧基端的肽键，该酶水解专一性相对较弱，能够在中性、弱酸性及弱碱性环境下对蛋白质进行酶解。在产品感官改良方面，中性蛋白酶能有效解决高蛋白发酵乳质地黏滞、口感粗糙的问题，通过切割特定肽键降低体系黏度、硬度及摩擦系数，并能显著提升丁酸、2,3-戊二酮等关键挥发性风味物质的含量，赋予乳制品更浓郁的酪香与脂香。 利用中性蛋白酶水解乳清蛋白可制备出高活性的生物活性肽，其分子质量主要分布在1 kDa以下，不仅显著增强清除自由基的抗氧化能力，还能通过增强肠道屏障完整性和调节菌群多样性，有效缓解结肠炎症。中性蛋白酶水解驴乳蛋白时，其溶解性显著提高，同时水解后ABTS阳离子自由基清除能力随水解时间的延长而增强，这归因于中性蛋白酶处理后能释放具有自由基清除能力的氨基酸残基或短肽组分。针对水牛初乳的一项研究发现，中性蛋白酶在特定条件下（pH 7.5、50 ℃）能高效释放具有免疫增强作用的活性肽，不仅显著提高ABTS阳离子自由基清除率，且能显著促进巨噬细胞增殖、吞噬及免疫因子的分泌。相较于碱性蛋白酶，中性蛋白酶水解更为温和，在保留一定凝胶潜力和风味品质方面更具优势，但其活性肽释放效率相对较低。

1.1.3 地衣芽孢杆菌蛋白酶对乳蛋白功能特性的改善作用

地衣芽孢杆菌蛋白酶是一类以优化乳蛋白凝胶性能为靶向的蛋白酶，其可通过对乳蛋白进行适度水解，诱导肽段自组装形成聚集体，进而实现对乳蛋白凝胶特性的改良。地衣芽孢杆菌蛋白酶能促使水解产物形成中等大小肽聚集体，通过疏水相互作用与静电作用显著提升乳清蛋白的凝胶速率和凝胶强度。研究发现，地衣芽孢杆菌蛋白酶对β-乳球蛋白的功能特性具有较好的改善作用，这些由特定酶解产生的肽段，其聚集能力与自身溶解性密切相关，不溶性肽段与部分可溶性肽段可通过疏水相互作用共同促进蛋白的非特异性聚集。总体而言，该蛋白酶的适度水解能综合改善乳清蛋白的凝胶性、乳化性和成膜性等功能，在食品工业中具有广泛应用潜力，但该酶对水解度的控制要求极高，水解度过低则凝胶性改善效果有限，水解度过高则会破坏肽聚集体的形成。

1.1.4 胃蛋白酶对乳蛋白功能特性的改善作用

胃蛋白酶由胃黏膜细胞分泌的胃蛋白酶原经激活后生成，该酶可特异性水解蛋白质分子中芳香族氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸）氨基端或羧基端的肽键。胃蛋白酶处理乳蛋白后可释放具有较好降糖活性的乳蛋白肽。在驼乳乳清蛋白的研究中，胃蛋白酶在45 ℃、120 min条件下水解2 h生成的低分子质量水解物对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶表现出极强的抑制潜力。胃蛋白酶酶解水牛乳后相较于碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶表现出更高的特异性，其制备的酪蛋白水解物中＜3 kDa的小分子肽段含有丰富的疏水性氨基酸，能够通过氢键和疏水相互作用与α-葡萄糖苷酶活性位点稳定结合。此外，在山羊乳清蛋白的模拟预测与验证实验中，尽管胃蛋白酶的水解度和蛋白回收率并非最高，但其水解产物仍能有效提高二肽基肽酶-IV（DPP-IV）的抑制率，呈现出良好的体外降血糖活性。总体来看，胃蛋白酶更适用于模拟胃消化过程制备特定生物活性肽，而在改善加工功能特性方面的应用相对有限。

1.1.5 胰蛋白酶对乳蛋白功能特性的改善作用

胰蛋白酶主要水解乳蛋白中赖氨酸与精氨酸残基的肽键，得到以精氨酸或赖氨酸为C末端残基的肽段，胰蛋白酶作为最常用的蛋白水解酶，催化特异性也最强。功能特性方面，酶解产生的两亲性短肽能增强界面吸附能力，使乳蛋白的乳化性提高。此外，胰蛋白酶酶解还能调节乳蛋白的凝胶特性，通过改变肽链间交联程度与凝胶网络致密性，改善凝胶的持水性、弹性与质构。然而，胰蛋白酶的局限性为天然β-乳球蛋白对其具有抗性，需对乳蛋白进行预热处理使其变性后才能实现高效水解。

综合不同蛋白酶的水解特性可以看出，酶水解并非通用改性手段，其功能改善效果高度依赖于酶的选择与水解程度控制。碱性蛋白酶和中性蛋白酶更适合用于降低致敏性和制备活性肽，但需防止过度水解。地衣芽孢杆菌蛋白酶在改善凝胶和质构方面表现突出，而胃蛋白酶和胰蛋白酶则更适用于定向释放特定生物活性肽。因此，在实际应用中，应围绕目标产品对溶解性、凝胶性、界面性能或生物活性的需求，选择合适的蛋白酶类型并精确控制水解程度。同时，单一酶解往往难以兼顾多重功能，这也为后续多酶协同及酶法与其他方法联合改性提供了理论基础。

酶促交联是指在特定酶的催化作用下，通过诱导乳蛋白分子间或分子内形成共价键实现肽链结构重构，将氨基酸从一条肽链转移到另一条肽链上实现对肽链的改造，进而优化乳蛋白的流变性、稳定性及界面功能等特性。目前用于乳蛋白改性的交联酶来源广泛，涵盖微生物、植物等多个类别，不同来源的交联酶因催化机制、作用靶点不同，其改性效果与功能调控方向存在差异，可分为酰胺键交联酶（谷氨酰胺转氨酶（TGase））与氧化交联酶（漆酶、酪氨酸酶、过氧化物酶）两大类，作用机制如图1所示。

1.2.1 TGase对乳蛋白功能特性的改善作用

研究表明，TGase介导的酶法交联能通过形成异肽键网络显著提升酪蛋白胶束的结构稳定性，使其在化学试剂（乙二胺四乙酸、乙醇）处理或高压环境下更具抗性。针对交联工艺的优化显示，反应温度是调控聚合物黏度的核心因素，在50 ℃、pH 8.0及5 U/g加酶量下反应60 min可实现最佳性能。同时，TGase在提升蛋白功能性方面展现出底物偏好性，其对浓缩乳蛋白的热稳定性、溶解度及持水力的改良效果显著高于胶束酪蛋白浓缩物。在相同的TGase添加量下，浓缩乳蛋白样品具有显著更高的热稳定性、溶解性和持水性。此外，将TGase加入牦牛酸乳中，TGase对牦牛酸乳持水力的改善效果优于酸乳，这归因于不同乳中酪蛋白含量的不同及牦牛酸乳形成的蛋白网络更为致密。同时，由于酪蛋白比球状结构的乳清蛋白具有更高的结构灵活性，含较高比例酪蛋白或结构较松散的乳源蛋白更易通过形成ε-(γ-谷氨酰)-赖氨酸共价键增强凝胶强度。

1.2.2 漆酶对乳蛋白功能特性的改善作用

除TGase外，漆酶也是实现乳蛋白功能化改性的重要交联酶。漆酶为含铜单电子氧化还原酶，主要通过单电子氧化机制诱导蛋白氧化交联。其与蛋白作用生成底物自由基，协同铜离子将巯基（—SH）氧化为二硫键（S—S）、酪氨酸残基氧化为醌，醌经Schiff碱加成或迈克尔加成与伯胺等活性氨基反应，实现蛋白质交联。漆酶将咖啡酸氧化为醌类或自由基，这些活性中间体随后与α-乳白蛋白分子中的Tyr、Lys、Cys及Trp等残基发生共价结合，通过形成C—C、C—O或C—N键催化蛋白聚合形成二聚体、三聚体及高分子聚合物。这一氧化聚合过程引发蛋白构象的显著改变，包括α-螺旋含量降低、内部疏水基团暴露，并显著提升体系的Zeta电位与表观黏度。这种独特的氧化交联模式通过增加蛋白分子的柔韧性及在界面的吸附厚度，最终有效改善乳蛋白的乳化与发泡性能。

1.2.3 酪氨酸酶对乳蛋白功能特性的改善作用

酪氨酸酶作为一种典型的氧化还原酶，当催化蛋白反应时，首先一元酚邻位羟基化为二元酚，再氧化成具有较高活性的苯醌，苯醌进一步与蛋白质中的游离氨基酸和—SH发生加成反应，最终形成酪氨酸-赖氨酸、酪氨酸-半胱氨酸、二酪氨酸。关于酪氨酸酶处理乳蛋白凝胶特性的研究发现，酪氨酸酶能通过催化乳清分离蛋白与酪蛋白酸钙交联形成高黏度凝胶。该研究表明，当添加量为6 g/100 mL、反应时间为60 min时，形成的黏性凝胶可有效替代低脂食品中的碳水化合物类增稠剂。此外，关于酪氨酸酶催化乳清蛋白聚合耦联超滤的研究表明，酶促交联诱导的蛋白聚合能显著提升超滤膜通量与蛋白回收率。同时，酪氨酸酶处理可有效降低总膜阻力与膜孔阻力，为缓解乳清蛋白回收过程中的膜污染提供新途径。

1.2.4 过氧化物酶对乳蛋白功能特性的改善作用

过氧化物酶作为典型的氧化型交联酶，可在过氧化氢存在下催化乳蛋白中酪氨酸等芳香族氨基酸残基发生自由基反应，形成共价交联并诱导蛋白分子内或分子间聚合。该氧化交联过程可改变乳蛋白分子构象与表面性质，为功能特性调控提供结构基础。以apo-α-乳白蛋白为模型蛋白的研究表明，过氧化物酶可使其由单体向二聚体及更高聚合体转化，二酪氨酸的形成是聚合关键，同时蛋白二级、三级结构重排，内部疏水基团暴露，表面疏水性显著增强。该酶还可氧化乳清蛋白酪氨酸形成二酪氨酸、促进游离巯基转化为二硫键，通过分子交联提升乳蛋白二级结构有序性、乳化活性与稳定性、流变性能及热稳定性，降低凝胶起始温度，进而优化其功能特性。

漆酶与酪氨酸酶可有效促进乳清蛋白与酪蛋白间的分子间交联，增强凝胶网络的刚性与热稳定性。过氧化物酶通常在过氧化氢存在下发挥作用，交联效率较高，但对反应条件的控制要求更为严苛。总体而言，氧化型酶促交联在蛋白结构强化方面具备良好应用潜力，其反应选择性调控与氧化副反应抑制是该领域未来重点关注的研究方向。

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乳蛋白物理改性

物理改性是指在不引入外源化学试剂的条件下，通过外界物理场作用改变乳蛋白的空间构象、分子间相互作用及聚集状态，从而实现功能特性的调控。从作用机制上看，物理改性主要通过诱导蛋白质部分展开及非共价相互作用重排实现功能改善，其调控深度相对有限但安全性高。超高压、动态高压微射流、高压均质和超声波等技术可通过温和调控乳蛋白的高级结构如展开、聚集、解折叠等的变化，改变其表面性质与分子间相互作用，从而改善其溶解性、乳化性和凝胶性，同时能最大程度保留乳蛋白的生理活性，是功能性乳蛋白改性的重要技术。

超高压处理通过施加≥100 MPa的静水压力，在不显著升高温度的条件下破坏蛋白质的非共价键（如离子键、氢键和疏水键等），但不改变共价键结构。超高压处理可显著改善水牛乳酪蛋白的功能特性，其中400 MPa为最优压力条件，能显著提升其乳化活性、持油能力、起泡性能及抗氧化活性。此外，超高压处理能显著改善乳清分离蛋白的功能特性与应用价值，不仅使ABTS阳离子自由基清除活性显著提升、乳化稳定性得到改善，还可有效降低β-乳球蛋白抗原性，且200～300 MPa处理能增强其胃消化性并进一步降低潜在致敏风险。牛乳和山羊乳酪蛋白胶束对超高压处理的响应存在显著差异，牛乳酪蛋白表现出更高的压力敏感性，而山羊乳酪蛋白因α_s1-酪蛋白含量低、β-酪蛋白含量高，且胶束中磷酸钙介导的交联更丰富，使超高压对山羊乳蛋白乳化性和泡沫稳定性的改善潜力优于牛乳。

动态高压微射流是一种利用高压剪切与湍流效应实现物料改性的加工技术。研究表明，其可以显著提升乳蛋白乳化性并使乳液液滴更小、分布更均匀，同时随压力升高可增强其消化产物的自由基清除能力，且不影响蛋白消化性与主要亚基完整性。此外，动态高压微射流处理不会破坏β-乳球蛋白和乳清分离蛋白与叶黄素的结合亲和力，且能保留乳蛋白对叶黄素的高效光保护作用，同时不影响乳蛋白自身的抗氧化能力。

高压均质是一种通过机械剪切与压力作用改性蛋白的食品加工技术。高压均质技术可有效修饰蛋白质结构，减小其粒径，从而改善功能性质。高压均质可以显著降低乳清分离蛋白的平均粒径和浊度，同时显著改善其表面疏水性、荧光强度和游离巯基含量，同时发泡能力也得到改善，为获得优良的新型乳清分离蛋白成分提供基础支撑。经60～120 MPa压力循环处理能显著降低乳清分离蛋白（12 g/100 mL）粒径与浊度，并诱导构象展开，以暴露内部的疏水基团和游离巯基，该处理有效提升乳清分离蛋白的乳化活性及热诱导凝胶硬度，为改善乳清蛋白基配料的功能特性提供支撑。此外，可通过诱导牛血清白蛋白部分解折叠并增加游离巯基（—SH）暴露，显著提高其对胰蛋白酶和α-糜蛋白酶的酶解反应速率，从而改善牛血清白蛋白的酶解敏感性这一关键功能特性。

超声通过空化效应产生的局部高温、高压及强剪切力，能够显著改变乳蛋白的分子结构，进而改善其溶解性、乳化性及凝胶性等功能特性。在乳清分离蛋白的改性研究中发现，300 W超声处理倾向于诱导蛋白分子去折叠并暴露疏水基团，而600 W的高功率超声则因过度剪切促进大聚集体的形成。这种结构转变直接影响其物理化学性质，使超声处理后的乳清分离蛋白在表面疏水性和巯基含量上均有显著提升。针对乳清蛋白微凝胶，超声处理能够有效减小其粒径并使电荷分布更加均匀，通过改善微凝胶的界面张力显著提升其泡沫稳定性。超声处理通过促进山羊乳脂肪球与蛋白质颗粒的均匀分布，减少分子间的聚集，构建更加紧密且有序的蛋白网络结构，从而提升山羊乳的热稳定性。此外，超声处理能够降低牛乳、山羊乳、水牛乳及驴乳的粒径并改变其黏度，不仅显著缩短各类乳的凝乳时间，还通过改变蛋白质的二级结构增强了凝乳酶诱导的凝胶强度，其中对驴乳和羊乳的改善效果尤为显著。与高压处理相比，超声改性更偏向于使乳蛋白分散与解聚，在改善溶解性和界面性能方面表现突出，但对凝胶结构的强化作用相对有限。

超高压、动态高压微射流、高压均质和超声等非热加工技术可通过温和调控乳蛋白高级结构实现其功能特性的改善，且能保留乳蛋白的生理活性与营养成分。各类非热加工技术的功能调控方向与应用场景差异显著。超高压更倾向于乳蛋白的乳化性与稳定性改善及致敏性降低；动态高压微射流适用于功能性成分乳基递送系统开发；高压均质可应用于澄清型、乳化型乳制品的基础改性；超声适用于乳的凝乳特性改善。单一非热加工技术的改性效果相对温和，未来需与酶法、化学改性结合进行协同改性，实现改性效果的叠加提升。

微胶囊化技术以乳蛋白作为壁材，通过将活性成分包封于乳蛋白或乳蛋白-多糖、脂质复合壁材中，实现对芯材结构稳定性和功能的调控。微胶囊化作为一种高效包装技术，并非直接改善乳蛋白自身的功能特性，而是通过拓宽乳蛋白作为载体的功能实现其高值化利用，优势为能掩蔽不良风味、减少活性成分挥发与降解，促进疏水性成分在水相体系中的分散。其中，喷雾干燥、静电纺丝/喷雾及复合凝聚法等因操作简便、应用范围广、包埋效率高，已成为食品活性物质包埋与稳定化的主流技术。

乳蛋白因其优异的成膜性和乳化性成为优秀的壁材，不同乳蛋白基壁材的成膜性、乳化性及包埋特性存在差异，需根据包埋对象的特性进行选择。利用乳清分离蛋白与海藻酸钠作为壁材构建的微胶囊载体，可显著提高马郁兰精油的负载量，并有效改善其抗菌活性。乳脂肪球膜（MFGM）是包裹乳脂肪球的薄膜，因其含有蛋白质和极性脂质的特殊组成而具有良好的乳化性和生物相容性，是益生菌、多不饱和脂肪酸等敏感活性成分的最优乳蛋白基壁材。MFGM表面的糖蛋白可以用于包埋生物活性物质，为递送系统提供应用依据。在活性成分递送系统中，经物理改性如微胶囊化、高压均质的乳清蛋白、酪蛋白及MFGM蛋白，凭借其增强的成膜性、乳化性和环境响应性，可作为高效载体用于包埋和保护益生菌、多不饱和脂肪酸如DHA及生物活性肽等敏感组分。源自酪蛋白的酪蛋白磷酸肽作为矿物质载体，因具有良好的矿物质结合能力，是钙、铁等矿物质的乳蛋白基壁材，研究证实其广泛应用于钙、铁强化饮料和保健品中。

乳蛋白凭借优异的成膜性与乳化性成为微胶囊化技术的理想壁材，不同乳蛋白基壁材的包埋应用场景不同。MFGM适配益生菌、DHA等敏感活性成分包埋，乳清分离蛋白适配精油等挥发性成分包埋，酪蛋白磷酸肽适配矿物质强化。未来的挑战在于提高包埋效率、负载量和在复杂食品体系及胃肠道环境中的靶向释放性能。将微胶囊化技术与前述的酶法、非热加工改性技术结合，预先优化乳蛋白壁材的功能特性如提高乳化稳定性、增强膜致密性或赋予pH值响应性，是提升微胶囊整体性能的关键方向。

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乳蛋白化学改性

化学改性是借助化学试剂与蛋白质相互作用，通过断裂部分肽键，或引入负电荷基团、二硫基团、亲水或亲油基团等功能性基团，实现蛋白质结构与功能调控的改性手段。与酶法改性和物理改性相比，化学改性对乳蛋白结构的影响更为显著，功能改善幅度较大，但同时也面临食品安全性和法规合规性方面的挑战。目前研究最广泛的为糖基化、磷酸化（去磷酸化）、酰化（去酰胺化）3 类。

糖基化改性是通过美拉德反应，使乳蛋白的氨基酸侧链（通常是赖氨酸的α-、ε-氨基）与还原糖的羰基发生共价结合，从而在蛋白质分子中引入亲水性糖链的化学方法。该方法是化学改性中安全性最高的一种，无需添加有毒化学试剂，且能显著改善乳蛋白功能特性。

糖基化改性对蛋白质凝胶化的影响较为显著，蛋白质和碳水化合物主要形成3 种类型的混合胶，分别为联合型、镶嵌型和相分离型。联合型凝胶是指2 种聚合物分子通过相互作用，形成共价交联的三维网络结构。镶嵌型凝胶中，2 种聚合物可构建出均一、连续的互穿网状体系。相分离型凝胶则因2 种聚合物存在热力学不相容性，受分子间斥力或对溶剂亲和性差异的调控，各自独立形成凝胶结构。糖基化根据反应体系是否有溶剂分为干法糖基化和湿法糖基化。

干法糖基化是在干热条件下发生的糖基化反应。对多糖与乳清蛋白进行反应，并对改性后蛋白的功能性质进行研究，发现在温度45 ℃、相对湿度68%条件下乳清蛋白与壳聚糖进行17 h的美拉德反应，糖基化产物的溶解性及乳化稳定性得到明显提高。探究乳清蛋白中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白及牛血清白蛋白，与分子质量分别为10 kDa和20 kDa的葡聚糖经干法糖基化改性后的功能特性变化。结果显示，10 kDa葡聚糖改性可使乳清蛋白获得比20 kDa葡聚糖更高的凝胶强度。该糖基化改性方式能显著提升牛血清白蛋白与β-乳球蛋白的热稳定性，同时使3 种蛋白质的溶解性均得到明显改善。此外，在乳清蛋白中加入羧甲基纤维素，发现加入羧甲基纤维素的乳清浓缩蛋白乳化稳定性更好。干法糖基化的局限性为反应周期长、改性效率低，工业化生产的耗时较长。

湿法糖基化适用于小分子的糖类反应，有反应周期短、反应速度快等优点，但也容易发生褐变。选用葡聚糖对乳清蛋白进行湿法糖基化改性，在反应pH 6.5、温度60 ℃、时间24 h条件下可显著提升改性产物的热稳定性与乳化特性。通过湿法糖基化将6 种单糖或双糖与β-乳球蛋白结合，发现糖基化显著增强接枝物的热稳定性，且核糖与阿拉伯糖主要提升乳化性，而半乳糖与葡萄糖则更有利于提高起泡性，这一结果明确五碳糖（核糖、阿拉伯糖）适用于乳蛋白的乳化性改善，六碳糖（葡萄糖、半乳糖）则更适用于乳蛋白的起泡性改善。

糖基化改性可通过干法或湿法工艺结合不同类型与分子质量的糖类，定向改善乳蛋白的溶解性、乳化稳定性、热稳定性及凝胶强度等核心功能特性。干法糖基化适用于大分子多糖、热敏感性乳蛋白的改性，湿法糖基化适用于小分子单糖或双糖、工业化量产的需求。该技术为乳蛋白的功能升级与高值化应用提供重要途径，此外，美拉德反应中后期可能产生的潜在危害物（如丙烯酰胺、糖基化终末产物）是限制其在高安全要求食品中应用的主要障碍。未来研究需利用更精准的分析手段解析糖基化修饰图谱，并开发新型、可控的美拉德反应途径以保障安全。

蛋白磷酸化是在蛋白激酶催化下，将ATP或5’-鸟苷三磷酸的γ-磷酸基团转移至目标蛋白丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基的过程。对乳清蛋白而言，该修饰通过酯化反应将磷酸根引入酪氨酸、苏氨酸、丝氨酸的 羟基（—OH）或赖氨酸、精氨酸的氨基位点，形成—C—O—P或—C—N—P键，从而增强蛋白电负性与分子间静电斥力，提高分散性，进而改善其溶解度、起泡性和乳化性。

常用磷酸化试剂包括磷酰氯、三聚磷酸钠、焦磷酸盐等。采用磷酸化试剂对乳清蛋白进行化学改性，结果表明，磷酸化不仅能影响蛋白质二级结构、降低色氨酸荧光强度，还可显著增强其稳定性、乳化性、发泡性及吸油吸水能力。

去磷酸化的改性机制为降低蛋白负电荷、改善消化酶对水解位点的可及性，从而提升乳蛋白消化特性，适用于老年、婴幼儿等消化功能较弱人群的特殊膳食开发。去磷酸化通过碱性磷酸酶催化降低酪蛋白（α-酪蛋白和β-酪蛋白）的磷酸化水平，减少分子表面负电荷并改变蛋白构象，既提升蛋白溶解性，又降低磷酸基团对消化酶胃蛋白酶、胰蛋白酶作用位点的空间阻碍，从而改善消化特性。因此，去磷酸化优化了酶与蛋白的结合效率，加速蛋白降解与肽段释放。去磷酸化可改善山羊酪蛋白胶束的功能特性，其可通过促使胶束中胶体钙逐步溶解、β-酪蛋白解离，同时使胶束粒径减小、水合度及内部均一性提升，结构更疏松。该变化促使酪蛋白胶束的磷酸化模式和微观结构更接近人乳酪蛋白胶束，进而拓宽其在婴幼儿配方乳粉等产品中的应用。

磷酸化通过引入带负电的磷酸基团，增强蛋白分子的静电斥力和亲水性，是改善溶解性、乳化性和热稳定性的有效方法，尤其适用于需要高分散性和界面活性的食品体系。然而，强磷酸化试剂可能存在残留风险。去磷酸化则通过去除蛋白固有的磷酸基团，降低负电荷密度，从而改变其与阳离子的相互作用以及酶切位点的可及性，主要应用于改善蛋白的消化特性或调节其聚集行为。未来需重点开发高效、低残留的磷酸化或去磷酸化工艺，同时评估改性产物在体内的消化吸收特性。

酰化处理通过在蛋白质分子中引入酰基，改变其电荷分布和疏水性，改善其功能特性，常用的酰化试剂包括乙酸酐和琥珀酸酐。乙酸酐的中性乙酰基（CH₃CO—）与蛋白质赖氨酸残基的氨基（—NH₂）结合，中和部分正电荷，从而提升蛋白质在溶液中的分散性。而琥珀酸酐主要是利用其琥珀酰基取代赖氨酸上的正电荷氨基，在蛋白质表面引入带负电的羧基，使整体电荷由正转负。这一变化促使蛋白质分子构象舒展，肽链柔韧性增加，进而显著增强其持水、持油能力，并改善乳化性与起泡性。牦牛乳酪蛋白胶束琥珀酰化修饰后，其乳化稳定性和乳化活性显著提高。酪蛋白酰化修饰反应条件温和，易调节，修饰程度高，所修饰酪蛋白的乳化性显著改善。此外，酰化改性通过改变蛋白质分子的表面疏水性和电荷分布，增强其与水分子和脂质的相互作用能力。

去酰胺化通过去除蛋白质分子中的酰胺基，增加负电荷数量，改善蛋白质的溶解性和乳化性。β-酪蛋白去酰胺后，α-螺旋含量增加，在油-水界面上吸附后呈现出更有序的结构。在pH 7、36 ℃条件下，反应1、4、8 h的脱酰胺度分别为1.5%、2.3%、2.9%，改性后蛋白电负性增强、等电点降低，起泡性、乳化稳定性及对Fe³⁺、Zn²⁺的螯合能力随脱酰胺度升高而提升，适用于矿物质强化食品。

酰化与去酰化均通过调控乳蛋白的电荷分布及表面特性实现功能优化，酰化剂的选择需结合产品功能需求，乙酸酐适配需保留凝胶性的乳制品，琥珀酸酐适配仅需改善乳化性的乳制品。未来需进一步优化改性程度以平衡功能特性与产品品质，开发低残留、高效的酰化或去酰化工艺。

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乳蛋白协同改性

单一改性手段在改善乳蛋白特定功能方面虽具有明确优势，但其调控范围有限，往往难以同时满足对溶解性、凝胶性、界面性能及营养功能的综合需求。协同改性通过2 种或多种改性技术协同，在不同结构层级上作用于乳蛋白分子，利用不同技术间的互补或增效作用，从而克服单一技术的局限性。

化学协同改性指采用2 种不同化学手段联合处理乳清蛋白，该技术具有操作便捷、适用范围广、改性成效突出等特点，能进一步优化蛋白质的功能特性，但相较于单一化学改性，化学协同改性需引入更多种类与剂量的化学试剂。通过干热法对乳清分离蛋白进行麦芽五糖糖基化与磷酸化联合改性，显著提升蛋白在pH 7.0下的热稳定性和乳化稳定性，并使热诱导凝胶在保持高硬度与持水力的同时呈现出优异的透明度。其机理在于糖链的空间位阻与磷酸基团的静电斥力共同作用，有效抑制蛋白分子的随机聚集。半乳糖糖基化联合焦磷酸钠磷酸化的化学协同改性，借助超声波预处理破坏蛋白构象并增加修饰位点，通过基团屏蔽与构象改变的双重作用，破坏线性与构象过敏表位，显著降低牛α-乳白蛋白的免疫球蛋白（immunoglobulin）E/IgG结合能力，抑制组胺和白细胞介素（IL）-6释放，最终大幅减弱其变应原性。糖基化、磷酸化、乙酰化修饰均能显著改善α-乳清蛋白的变应原相关功能特性，通过修饰其线性表位与构象表位、改变蛋白空间结构，显著降低IgE和IgG结合能力及RBL-2H3细胞组胺与IL-6释放量，其中乙酰化修饰因修饰位点最多效果最优。化学协同改性通过叠加不同化学修饰的效应，实现热稳定性、乳化稳定性和低致敏性等功能的协同增效。然而，在提升功能的同时，可能引入更复杂的试剂残留混合物，导致未反应残留试剂的分离纯化难度增加，增加安全评估和纯化工艺的难度。

酶法协同改性是通过2 种酶制剂联合作用处理乳清蛋白的技术手段。采用胃蛋白酶与胰酶联用模拟人体胃肠道消化环境以消除乳清蛋白的致敏性，利用乳蛋白过敏患者血清进行的免疫学表征显示，该酶组合具有高度的切割特异性，能够完全消除牛血清白蛋白和IgE结合活性。胃蛋白酶与木瓜蛋白酶协同水解α-乳白蛋白，可通过互补酶切使肽段分子质量均＜3 kDa、改变蛋白结构，降低其致敏性并调节免疫与肠道菌群，减敏效果显著优于单一酶解。通过对乳清分离蛋白进行酶解与TGase交联，发现在中度水解度下蛋白表现出最佳的热稳定性、溶解度及表观黏度。同时改变蛋白的二级结构及空间构象，从而协同改善水解产物的流变学特性和乳化稳定性。利用碱性蛋白酶或胰蛋白酶对乳清分离蛋白进行酶解后，引入TGase诱导交联可以部分修复因水解造成的表面疏水性、乳化性及泡沫性能的损失。这种联合工艺利用TGase产生的共价交联改变蛋白的分子质量分布，使改性后的产物在保持较低分子质量的同时，仍能保留较好的界面活性及功能特性。采用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶及胃蛋白酶进行多酶协同水解时，牛乳与驼乳蛋白表现出显著的降解动力学差异，驼乳源水解产物在抗真菌活性等方面表现更为突出。这种功能特性的差异主要源于驼乳缺乏β-乳球蛋白且富含α-乳白蛋白和乳铁蛋白，这为多酶体系提供不同的切割位点，从而赋予驼乳水解物更强的生物活性。酶法协同是实现高效、深度改性的有效方法。其协同模式主要包括：1）多酶水解，利用不同蛋白酶切割位点的互补性，实现更彻底的水解或生成特定序列的活性肽，尤其在降低致敏性方面效果显著；2）水解和交联联用，先通过有限水解暴露更多反应位点或产生功能前体，再由交联酶进行重构，可以综合获得小分子肽段的活性和大分子或聚集体的质构功能，有效避免深度水解导致的功能损失。酶法协同的优势是产物清洁、安全性高，但成本控制是关键挑战，未来需发掘更多高活性、低成本的工业用酶，并利用计算模拟辅助设计多酶协同作用的最优方式。

物理与酶法协同改性是将物理改性技术与酶法改性相结合的策略，该法兼具物理改性的安全性和酶法改性的精准性，是目前研究最为成熟、工业转化潜力最高的协同改性模式。在超高压处理条件下，采用胰蛋白酶与胃蛋白酶联合处理乳清分离蛋白，所得水解产物的抗原性及与人体Ig的结合能力显著降低。当水解物pH值接近乳清蛋白等电点时，其热稳定性得到提升，在pH 7的环境中，改性产物的乳化性能显著增强。超声辅助碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶酶解能显著提升驼乳酪蛋白水解物的水解度，同时大幅增强其抗氧化和DPP-IV抑制活性，其中α-胰凝乳蛋白酶与超声结合实现最高水解度，碱性蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶的超声辅助水解物具有较强抗氧化活性，木瓜蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶的超声辅助水解物则展现出最强的DPP-IV抑制效果。研究发现，超声波预处理与微生物TGase的协同作用可使乳清蛋白浓缩物呈现出非牛顿剪切稀化特性，该特性有助于优化乳清蛋白体系的各种功能特性。

此外，化学改性还可以与物理改性和酶法改性协同达到改善乳蛋白功能特性的目的。糖基化修饰与微波加热协同作用可显著改善α-乳白蛋白的功能特性，相比传统加热，该协同体系能提升糖基化反应速率，如提高反应速率常数（k）、降低活化能（E_a），更高效地增强产物总抗氧化能力与α-葡萄糖苷酶抑制活性，同时通过调控蛋白表面疏水性与聚集状态，进一步优化其功能应用潜力。超声处理能显著加速羊乳清蛋白与半乳糖之间的美拉德反应，缩短糖基化时间并提高接枝度。超声的空化效应使羊乳清蛋白分子结构展开，暴露更多内部的氨基，从而在协同反应中形成具有更高溶解性、热稳定性及抗氧化活性的糖基化产物。这种协同处理不仅增强蛋白的乳化性能，还显著改善其在酸性条件下的持水能力。就化学改性与酶法改性协同而言，乳糖糖基化与微生物TGase协同修饰可显著优化乳蛋白的功能特性，不仅提升其低pH值下的溶解度、乳化活性，增加起泡体积，还能显著改善酸乳的理化性能。其中100 ℃协同处理组的黏度、硬度及持水性均最优，并获得最高感官总接受度，且修饰效果随加热温度升高而增强。

目前来看，物理和酶法协同是目前最具应用潜力的改性策略，物理处理作为预处理，可以温和地打开蛋白质的高级结构，暴露更多的酶作用位点或反应基团，从而显著提高后续酶法如水解或交联或化学反应的效率，减少酶用量或缩短反应时间。而涉及化学改性的协同体系仍需在安全性和法规层面进一步验证。未来研究需聚焦物理和酶法协同的智能化工艺参数匹配、低成本高效物理改性设备的开发，同时建立不同物理预处理方式与乳蛋白结构、酶作用位点的量化关系。

本文系统综述乳蛋白改性技术及其在功能特性调控中的应用价值。物理改性侧重安全性与规模化，酶法改性优势在于精准性与活性保留，化学改性具备高效性与低成本，协同改性则可实现功能叠加，不同改性技术的特点总结如图2所示。酶法改性通过特异性水解或交联反应，实现乳蛋白抗原性降低、凝胶强度提升等。物理改性依托非热加工与微胶囊化技术，在保障产品安全性的同时有效改善乳蛋白溶解性、乳化稳定性及活性成分保护能力。而化学改性通过引入功能性基团，优化乳蛋白的电荷分布、疏水性及热稳定性。协同改性则整合不同技术优势，实现功能特性的进一步优化，更能满足食品工业对乳蛋白多元化、高品质的需求。

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结 语

乳蛋白改性技术为其功能拓展和高值化利用提供重要手段，不同改性策略在作用机制、功能改善方向及产业化应用方面各具特点。单一改性方法已难以满足现代食品体系对乳蛋白多功能化和精准调控的需求，协同改性正逐渐成为该领域的重要发展趋势。未来乳蛋白改性技术突破应聚焦3 个优先方向：1）优先发展物理和酶法绿色协同策略，以兼顾功能提升、安全性与清洁标签；2）深化分子层面构效关系研究，借助分子动力学模拟、质谱与多组学解析酶切、交联、糖基化位点与功能网络图谱；3）系统开展改性产物的长期安全性评价，尤其是婴幼儿、老年人群的消化性、致敏性与代谢影响，建立分级安全评估框架。应同时解决机制不清与安全性评估两大问题，乳蛋白才能从基础原料跨越为高值化功能配料，推动特殊医学用途食品、高端功能乳品与精准营养领域的升级。

引文格式：

巩涵, 胡非寒, 陈美玲, 等. 乳蛋白改性技术及其对功能特性影响研究进展[J]. 乳业科学与技术, 2026, 49(2): 51-62. DOI:10.7506/rykxyjs1671-5187-20251218-088. http://www.dairyst.net.cn

GONG Han, HU Feihan, CHEN Meiling, et al. Recent advances in milk protein modification: techniques and functional implications[J]. Journal of Dairy Science and Technology, 2026, 49(2): 51-62. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/rykxyjs1671-5187-20251218-088. http://www.dairyst.net.cn