在分子中电子云分布决定了分子轨道的空间分布和能级差，进而使电子在吸收能量后出现不同的电子跃迁从而呈现出不同的紫外吸收光谱特征，而OTA又以OTA、OTA^-、OTA^2-的形式存在于不同的pH值范围中，具有不同的电子云分布。因此，测定了pH值为2～10时OTA与适配体-OTA复合物的紫外吸收光谱。由图1A可以看出，随着pH值的不断增大，OTA紫外吸收光谱最大吸收峰由333 nm处逐渐红移至375 nm处，且在pH值范围为6～10时先增色后减色。在pH 2～4时OTA随着pH值增加紫外吸收光谱未发生明显变化，Dohnal等研究发现在强酸性环境中苯丙氨酸部分的羧基未解离的OTA占96%，此时OTA以非离子状态存在，因此谱图随pH值升高未发生明显变化。随着pH值的增加，OTA在pH 6～8时出现增色现象，该pH值范围内OTA分子中的酸性基团（如羧基）与碱性基团（如羟基）发生去质子化反应形成相应的负离子，此时OTA电子云密度增加，其吸收紫外光的能力随之增强，因此在紫外吸收光谱上表现为吸光度增加，即增色效应。Cagnasso等发现，在强碱性环境中OTA会发生降解导致OTA物质的量降低。因此在pH 10时OTA吸光度降低归因于OTA的部分降解。研究发现，在不同pH值水溶液中二吡啶酸的吸收光谱直接取决于它的离子形式（中性、一价和二价阴离子）。由此推测，OTA在不同pH值溶液中呈现出不同的紫外吸收光谱特征，主要原因为OTA以不同离子形式存在于不同的pH值环境中。

加入适配体后，适配体-OTA的紫外吸收光谱（图1B）在pH 2～4之间未发生明显变化。分析原因是由于OTA的pK_a分别为4.2～4.4和7～7.3，此时OTA以非离子状态存在，与适配体的相互作用没有发生明显变化。当pH 6时，紫外吸收光谱发生减色并伴随微弱的红移，而Long理论将红移和减色现象作为小分子与DNA发生嵌插作用的判断依据。由此推断，在该pH值条件下OTA^－与适配体发生了嵌插作用。当pH值为7时，紫外吸收光谱发生明显的红移、增色现象。说明OTA^2-与适配体磷酸基团存在静电作用，且OTA^2-电子云密度较高，使其本身的吸收光谱发生较大红移。OTA在与适配体G-四链体结构结合后导致适配体轴向收缩，形成的共轭体系更加稳定，紫外吸收进一步向长波长移动。

依据OTA的pK_a值及核酸适配体的生理pH值，测定了pH值为4和7时，不同阳离子环境适配体-OTA的紫外吸收光谱。当pH 4时（图2A），Ca²⁺与Mg²⁺的加入使适配体-OTA出现红移与增色现象，而K^＋与Na^＋的增色现象相对较弱。表明此时Ca²⁺与Mg²⁺的加入对适配体-OTA以嵌插作用结合仍有一定的促进作用。但相较pH 7时，金属离子对适配体-OTA的影响减弱，主要原因是pH 4时OTA以非离子状态存在，在与适配体结合时，二者的相互作用没有发生明显变化。如图2B所示，当pH 7且Ca²⁺存在的条件下，紫外吸收光谱在330 nm处吸收峰出现明显的红移、减色现象，且在380 nm处出现新的吸收峰，说明此时适配体-OTA存在嵌插作用，适配体-OTA形成了新的复合物。在加入Mg²⁺后，紫外吸收峰红移至380 nm，并且吸光度增强，说明Mg²⁺的加入使得适配体-OTA的结合发生变化，全部以新的复合物形式存在。加入Na⁺时，紫外吸收光谱并未出现明显变化，说明此时Na⁺对二者结合几乎没有影响。而K⁺的加入，使得光谱图发生增色效应。有研究表明，K⁺与Na^＋诱导形成的四链体类型不同，K^＋为平行G-四链体，而Na^＋为反平行G-四链体。因此，在K^＋条件下OTA^2―没有以嵌插作用结合至平行G-四链体，二者结合后的π轨道因电子缺失，π-π*跃迁几率增加，产生增色效应。

Ca²⁺带有两个正电荷，可更好地中和适配体磷酸骨架和OTA负离子携带的负电，形成稳定的共轭体系，广泛应用于以适配体为识别元件的OTA检测方法。因此，分别测定了pH 4和7条件下，不同浓度Ca²⁺对适配体-OTA体系紫外吸收光谱图的影响。在pH 4条件下，随着Ca²⁺浓度的增加，出现先增色后减色的现象，但未发生明显的红移（图3A）。当pH 7时，随着Ca²⁺浓度的增加，适配体与OTA的相互作用体系在333 nm出现明显的红移、减色现象，并在原吸收峰的右侧（380 nm）出现新的吸收峰，尤其是Ca²⁺浓度为1、2、3 mol/L时，现象更为明显（图3B）。说明在Ca²⁺加入过程中适配体与OTA的结合方式发生变化，主要是以嵌插作用结合，且随着Ca²⁺浓度的不断增大，嵌插作用随之加强。同时，新吸收峰的强度同样随着Ca²⁺浓度的增加而增强，表明较大浓度的Ca²⁺有助于适配体-OTA形成一种具有更好共轭体系的新复合物。

为进一步验证pH值对OTA与适配体的影响，测定了pH值为2～10范围内OTA-适配体的荧光发射光谱图。如图4A所示，在pH值为2～6的范围内，随着pH值的增加OTA的荧光强度随增加，pH 6时小分子负电荷分布均匀，电子离域化，π电子所受束缚较小，荧光强度通常较高。由此说明，在pH 2～6的范围内，体系中负电荷的分散程度随pH值增加而变大，此时体系稳定性随之变强。当pH值继续增大（pH值为7～10）时，体系中OTA的酚羟基与羧基去质子化带负电，主要以OTA^2－形式存在，其负电区域主要分布在酚羟基与羧基区域，致使OTA^2－电荷分布不均，共轭体系被破坏，不利于电子离域，导致荧光强度降低。杜黎明等研究不同酸碱条件下的喹诺酮分子，发现质子化和去质子化荧光光谱分别会发生红移和蓝移现象。而pH值为2和10时，适配体-OTA的荧光光谱分别发生红移和蓝移现象，这可能与OTA质子化和去质子化作用相关。当然，DNA在强酸强碱的环境中其碱基之间的氢键会发生断裂而导致变性，这同样会导致pH值为2和10时OTA-适配体荧光发射光谱变化。由以上结果可知，OTA与适配体1.12.2结合的最佳 pH值范围为6～7。在pH 7时加入适配体1.12.2后，适配体-OTA最大发射峰强度相较单独OTA增加约11.39%（图4B）。是由于适配体中丰富的鸟嘌呤通过Hoogsteen氢键连接形成多个环状平面的G-四分体，当OTA以嵌插方式进入到适配体中时，G-四分体与OTA通过堆积作用使适配体-OTA体系更加稳定，荧光发射光谱呈现荧光增强。

金属离子与DNA中的五碳糖和碱基对等相互作用时均会影响小分子物质与DNA的结合，同时金属离子作为荧光猝灭剂通过电荷转移降低电子跃迁偶极矩，从而使小分子荧光量子产率低，为验证不同金属离子对适配体与OTA结合的影响，测定了在pH值为4和7的条件下，加入不同金属离子时适配体-OTA的荧光光谱图。如图5所示，当pH 4时，金属离子的加入对适配体-OTA的荧光发射光谱影响较小，此时OTA分子与金属离子的静电作用较小，OTA的电荷分布及适配体-OTA结构基本保持不变，对OTA与适配体的结合影响较小。当pH 7时，Ca²⁺与Mg^2＋的加入出现明显的荧光猝灭现象，发射峰强度分别降低17.02%与26.11%，此时OTA^2－与金属离子的静电结合直接导致体系荧光强度的降低，说明此时体系更加稳定。而K^＋与Na^＋的加入对荧光发射光谱影响较小，发射峰强度分别降低0.16%与0.34%，表明一价金属离子对OTA^2-的电荷中和能力较弱，对适配体与OTA的结合的影响小于二价金属离子。综上所述，高价金属离子对OTA^2-的电荷中和能力强于低价金属离子，在pH 7时加入Ca²⁺与Mg²⁺可明显增强适配体-OTA结构稳定性。

为验证Ca²⁺对适配体与OTA结合的影响，测定了在pH值为4和7的条件下，加入不同浓度Ca²⁺时适配体-OTA的荧光光谱图。当pH 4时，适配体-OTA的荧光发射光谱伴随Ca²⁺的加入未表现出明显变化（图6A），说明Ca²⁺没有对非负离子状态的OTA和G-四链体高电负性的孔道环境产生较大影响，因此适配体-OTA荧光发射光谱未发生明显变化。当pH 7时，随着钙离子浓度的增大，OTA荧光发射光谱出现蓝移和减色现象，且效果相较pH 4更加明显（图6B）。表明钙离子对带负电的OTA小分子的影响更强，使得OTA负离子共轭体系的电子云密度改变导致荧光猝灭，是荧光物质（适配体-OTA）与猝灭分子（Ca²⁺）之间相互作用所致。随着Ca²⁺的加入，适配体-OTA与Ca²⁺相互作用增强，体系的荧光强度随之降低。综上所述，在pH 7时高浓度的Ca²⁺有助于增强适配体-OTA共轭体系的稳定性。

CD谱作为分析DNA与小分子结合前后构象变化的有效工具，可准确分析游离DNA及DNA-小分子复合物的结构状态。当在CD谱图240 nm和260 nm附近处分别观察到负峰及正峰，表明为平行G-四链体结构，260 nm附近的负峰和290 nm附近的正峰则是反平行G-四链体的特征峰，而混合G-四链体结构在240 nm出现负峰的同时，在260 nm与290 nm附近均显示正峰。为分析不同pH值条件对适配体-OTA复合物结构的影响，测定了pH值为2、4、7时适配体-OTA的CD谱图。如图7所示，当pH值为4与7时，适配体-OTA复合物在240 nm与280 nm左右处分别出现负峰与正峰，这是由于适配体链内碱基间通过互补配对形成氢键。而pH值为7时的正负峰强度（椭圆度）均高于pH值为4。更高的椭圆度通常意味着更加紧密的碱基堆积，形成更稳定的二级结构，因此当pH值为7时适配体与OTA的结合亲和力强于pH值为4，且结构更加稳定，这一结果与紫外和荧光光谱一致。当pH值为2时，CD信号最弱，曲线较为平坦，且正峰向长波长方向移动。表明较低的pH值可能导致适配体结构松散，有序性降低，适配体与OTA结合受阻且结构稳定性降低。此外，pH 2时OTA以非离子状态存在，此时OTA与适配体氢键形成减少从而结构稳定性降低。

测定pH值分别为4与7条件下4种金属离子对适配体-OTA的CD谱图，结果发现当pH值为4时，Na⁺的加入未明显改变适配体-OTA的CD谱图，说明此时Na⁺对二者结合几乎没有影响（图8A）。K⁺的加入则增强了CD的椭圆度但未改变其峰位置，表明K⁺增强了适配体-OTA结构稳定性，但未改变适配体-OTA结构状态。当加入Ca²⁺与Mg²⁺时，正峰有向长波长移动趋势，诱导适配体-OTA形成混合G-四链体。当pH值为7时，Ca²⁺与Mg²⁺的加入使适配体-OTA在240 nm附近形成负峰，260 nm附近出现次高峰，290 nm附近出现正峰（图8B）。表明Ca²⁺与Mg²⁺诱导适配体-OTA形成了混合G-四链体结构。K⁺与Na⁺的加入相较pH 4时对椭圆度的增加更加明显，表明此时K⁺与Na⁺可更好的增强适配体-OTA结构稳定性。综上所述，当pH 7时，金属离子可更好地促进适配体与OTA的结合并增强结构稳定性，且二价金属离子可诱导适配体形成混合G-四链体。

张剑姝等研究发现，金属离子不仅对适配体外层磷酸糖骨架所带的负电荷具有中和作用，同时可进入G-四链体结构内部与DNA发生静电作用从而改变DNA结构状态及稳定性。为分析Ca²⁺对适配体的静电作用，在pH 7的条件下向适配体-OTA体系中加入不同量的Ca²⁺。如图9所示，当加入少量Ca²⁺时适配体-OTA在290 nm处出现肩峰，而随着Ca²⁺浓度增加，适配体-OTA结构发生改变，形成混合G-四链体结构。由此表明，Ca²⁺可能首先与适配体的磷酸骨架发生静电中和作用从而稳定适配体-OTA结构，随着Ca²⁺浓度增加磷酸骨架所带的负电被中和，Ca²⁺开始进入DNA内部，通过与G-四链体结构发生静电作用而促进结构稳定性。

为更加深入地分析适配体与OTA相互作用关系，将适配体1.12.2作为靶向分子与OTA进行了分子对接计算。图10显示了适配体1.12.2-OTA复合物结合自由能最低时的结构模型。通过观察，发现适配体中部分碱基发生了互补配对，经自身折叠形成了螺旋结构，且DG-6、DG-12、DG-15、DG-25形成了G-四分体平面结构。而螺旋结构中的凹槽可为OTA提供结合位点，G-四分体平面与OTA通过π-π堆叠结合地更加紧密。此外，适配体DG-5与OTA异香豆素环部分的羟基及苯丙氨酸部分的羧基形成了氢键，氢键距离分别为2.6 Å与2.5 Å，DG-27与OTA苯丙氨酸部分的羧基同样形成了氢键相互作用，距离为2.1 Å。通常认为强氢键的氢键距离小于3 Å，由此说明适配体与OTA之间形成强氢键作用，结构稳定。综上所述，OTA平面小分子通过嵌插作用结合在G-四分体平面一侧的沟槽中，并利用π-π堆叠和强氢键作用形成稳定的复合物结构。此外，pH值条件会影响羟基和羧基，使其发生去质子化。当pH 7时，OTA中羟基和羧基去质子化后形成—COO^-与—O^-负离子，负离子与适配体碱基形成更加稳定的离子键代替氢键。这一结果与不同pH值时适配体-OTA荧光光谱变化一致，即相比低pH值条件，pH 7时荧光发射光谱的蓝移与减色现象更加明显。

表1列举了10种适配体与OTA分子对接自由能打分最低的结果，其中对接结果1结合自由能最低，为－8.371 kcal/mol，此时适配体-OTA复合物结构最稳定。因此，选择对接结果1的结合自由能计算解离常数K_d，约为725 nmol/L。解离常数是评估适配体与靶标结合亲和力的关键参数，当K_d处于微摩尔（μmol/L）与纳摩尔（nmol/L）级别时表明二者具有较强的结合亲和力。Cruz-Aguado等发现当溶液存在20 mmol/L Ca²⁺时，适配体1.12.2对OTA的亲和力明显增强，解离常数为49 nmol/L。但这一结果远低于本研究计算的解离常数，可能与分子对接计算过程未考虑金属离子对G-四链体结构的稳定作用有关，说明Ca²⁺能够有效提升适配体与OTA的结合亲和力。而Xu Guohua等在含10 mmol/L Mg²⁺、120 mmol/L Na⁺、5 mmol/L K⁺的缓冲液中，采用等温量热滴定法测定含有32个碱基的适配体与OTA的解离常数（K_d＝84.9 mmol/L），显著高于725 nmol/L，说明该适配体对OTA的亲和力降低，复合物稳定性变弱。分析原因，一方面适配体序列的长度变化决定了适配体亲和力，另一方面金属离子种类对适配体与OTA的结合同样具有重要影响。以上关于适配体与OTA解离常数的研究，均显示二者可以稳定结合，而通过改变检测溶液金属离子的种类和浓度能够有效增强适配体与OTA结合的亲和力与稳定性，进一步证明适配体作为OTA识别元件开发生物传感技术的可行性与可靠性。

本研究采用紫外吸收光谱法、荧光光谱法、CD光谱法及分子对接技术研究不同pH值和金属离子条件对适配体1.12.2与OTA结合的影响。通过紫外吸收光谱分析发现，当pH 7且Ca²⁺存在的条件下适配体1.12.2与OTA以嵌插作用进行结合，Ca²⁺可加强适配体-OTA的嵌插作用，并增强复合物的结构稳定性。荧光光谱与CD光谱进一步证实适配体与OTA结合的最佳pH值范围为6～7，且Ca²⁺与Mg²⁺可诱导适配体-OTA形成混合G-四链体结构。结合分子对接模型发现OTA结合在适配体DG-6、DG-12、DG-15、DG-25碱基形成G-四分体平面一侧，适配体1.12.2与OTA解离常数K_d为725 nmol/L，二者有较强的亲和力。以上结果为基于适配体特异性检测技术的开发提供了理论依据，并为适配体与其他小分子的结合研究提供参考。但不同pH值与金属离子对适配体-OTA具体结合位点的影响需要进一步结合多种核磁共振波谱及分子动力学模拟等技术进行研究解析。此外，目前适配体的筛选以SELEX方法为主，获得的序列长度通常大于实际需求。因此，结合目前适配体与小分子结合机制的研究，开展适配体序列优化，有望获取序列更短、亲和力更强、稳定性更好的适配体。

作者简介

通信作者：

南米娜，高级实验师，甘肃农业大学理学院研究生导师。研究方向为果蔬采后生物学与技术，主要从事病害果蔬中真菌毒素的检测、代谢与消除等方面的研究。重点开展真菌毒素生物传感器等快速检测技术的研发，及真菌毒素脱除材料的制备与消除机理研究。先后主持国家自然科学基金、甘肃省自然科学基金、甘肃教育科技创新项目青年博士基金、甘肃教育科技创新基金等国家和省部级科研项目多项。近年来，在《Food Chemistry》《Food and Bioprocess Technology》《Foods》《Toxins》《食品与发酵工业》《食品安全质量检测学报》等国内外学术刊物发表论文40余篇。获甘肃省高等学校科研优秀成果三等奖、指导中国国际大学生创新大赛获得铜奖。

毕阳，教授，甘肃农业大学食品科学与工程学院博士生导师。研究方向为果蔬采后生物学与技术、果蔬品质及活性成分分析与评价、真菌毒素代谢、检测与消解。先后主持完成十三五国家重点研发计划子项目“食用菌减损保质储存流通新技术体系构建与示范工程”、国家自然基金中-以国际合作项目“扩展青霉定殖苹果果实的致病性及棒曲霉素合成的分子调控研究”、科技部中-俄国际合作项目“沙棘浆果采收设备与非热加工关键技术研究”、农业部行业专项“西北特色水果贮运保鲜技术集成与示范”、863项目“果蔬产后生物污染物消减与脱除技术研究”和国家自然基金面上项目等国家和省部级科研项目20余项。在国内外学术刊物及国际会议论文集上发表论文300余篇，其中SCI论文100余篇。

第一作者：

田海兵，甘肃农业大学硕士研究生，研究方向为生物与制药工程，主要从事果蔬采后真菌毒素检测与消解技术。