2026年6月11日，甘肃农业大学和北京农林科学院团队在Plant Stress期刊在线发表了题为“ABA/JA activated bHLH transcription factor PalBH1 is involved in cold tolerance in Pennisetum alopecuroides”的研究论文。该研究在狼尾草中鉴定并功能验证了一个IBH1-type的bHLH转录因子PalBH1，阐明了其通过整合ABA和JA信号，激活下游抗氧化和胁迫响应基因，协同增强光合作用稳定性与ROS清除能力的分子机制，为牧草及作物的抗寒遗传改良提供了重要的基因资源。
狼尾草（Pennisetum alopecuroides）是重要的饲草和生态修复资源，但因多数品种天然缺乏耐寒性，在北方温带和高海拔地区的推广受到限制。尽管已知CBF转录因子调控网络在植物冷适应中发挥核心作用，但其调控网络尚不完整，关键基因挖掘仍不足。尤其是IBH1这类非典型的bHLH转录因子，虽在整合激素信号与平衡生长发育中已知名，但其在冷胁迫响应中的直接功能在禾本科作物中尚属空白。因此，挖掘本地耐寒狼尾草种质中的关键基因，解析其分子机制，具有重要的理论和应用价值。
研究团队对10份狼尾草种质进行冷胁迫处理（0°C、-5°C、-10°C），结果显示LQ品种叶片卷曲和生长抑制最轻，而DF受害最重（图1A）。进一步测定株高、鲜重、叶面积、叶绿素荧光参数（Fv/Fm）和气孔导度（Gs）等指标，LQ在各指标中均表现最优（图1B-G）。主成分分析和聚类热图将10份种质分为耐寒型（LQ、CAS）和冷敏感型（DF等）（图1I-J）。这些结果为后续转录组分析奠定了材料基础。
LQ叶片的进行多温度梯度（22°C、10°C、5°C、0°C、-5°C、-10°C）转录组测序结果中，主成分分析显示样品重复性良好（图2A）。差异表达基因（DEGs）数量随胁迫程度变化，在5°C和10°C时DEGs最多（超过8000个）（图2D）。韦恩图显示共有548个基因在所有冷处理中共同差异表达（图2C）。GO富集分析表明，这些共同DEGs显著富集于氧化还原酶活性、叶绿体功能、蛋白修饰等与冷适应密切相关的生物学过程（图2E）。
图3 加权基因共表达网络分析锁定核心枢纽基因PalBH1
通过WGCNA将DEGs划分为19个共表达模块（图3A）。模块-性状相关性分析显示，turquoise模块与10°C处理高度正相关，green模块与5°C相关，dark turquoise模块与-10°C相关（图3C）。Turquoise模块基因在10°C时表达峰值显著（图3D）。功能富集表明该模块参与催化活性和胁迫响应（图3F）。进一步筛选出连接度最高的枢纽基因——IBH1（Pal04G038550），命名为PalBH1（图3E），将其作为后续研究的核心候选基因。
图4 PalBH1的分子特征、表达模式及其与耐寒性的相关性
PalBH1基因含有两个外显子和一个内含子，编码195个氨基酸（图4A）。进化分析显示其与狗尾草、小米等禾本科IBH1同源蛋白亲缘最近（图4B）。亚细胞定位证实PalBH1-GFP融合蛋白定位于细胞核（图4C）。冷胁迫下，PalBH1在LQ的根、茎、叶中均被显著诱导，分别在6h、4h和8h达到峰值（图4D）。在10份种质中，耐寒种质LQ和CAS的PalBH1表达量显著高于冷敏感种质（图4E）。GUS染色显示其启动子在拟南芥根、茎、叶中广泛表达（图4F）。相关性分析表明，PalBH1表达量与叶宽、叶面积、Fv/Fm和蒸腾速率正相关，与萎蔫率负相关（图4G），证实其与耐寒性紧密关联。
在拟南芥中异源过表达PalBH1，获得OE-24和OE-28两个高表达株系（图5A-B）。-5°C冷胁迫处理12小时并恢复72小时后，野生型植株严重萎蔫，而过表达株系生长良好（图5C）。OE-24的鲜重是野生型的1.70倍，萎蔫率仅为野生型的33.4%（图5D-E）。过表达株系的叶绿素含量、Fv/Fm、PIabs、PItotal等光合参数均显著高于野生型（图5F-I），OJIP曲线下降更平缓（图5J）。这些结果表明PalBH1通过保护光合系统和维持膜完整性增强耐寒性。
图6 PalBH1增强ROS清除能力并激活抗氧化系统
DAB和NBT染色显示，冷胁迫下过表达PalBH1的拟南芥叶片中H₂O₂和O₂·⁻积累明显少于野生型（图6A-B）。定量测定进一步证实，过表达株系的H₂O₂和O₂⁻含量比野生型低10.67%-21.48%（图6C-D），膜脂过氧化产物MDA含量降低15.28%-17.04%（图6E）。同时，过表达株系的POD、SOD和CAT抗氧化酶活性显著升高（图6F-H），脯氨酸和可溶性糖等渗透调节物质含量也明显增加（图6I-J）。这表明PalBH1通过增强抗氧化防御和渗透调节能力来缓解冷诱导的氧化损伤。
图7 转录组分析揭示PalBH1调控的下游基因网络
对过表达株系（OE-24和OE-28）在冷胁迫时间序列（0-8h）进行转录组分析，鉴定出大量DEGs（图7A-B）。两个株系共同响应的核心DEGs有65个（图7C），GO富集显示这些基因主要参与“对刺激的响应”、“对非生物刺激的响应”和“对胁迫的响应”等过程（图7D）。热图显示，其中NAC019、SWEET13、HAI2和PYL6等胁迫相关基因在过表达株系中受冷诱导的上调幅度显著高于野生型（图7E），提示它们可能是PalBH1的关键下游靶基因。
图8 ABA和JA协同激活PalBH1表达以响应冷胁迫
PalBH1启动子区含有ABRE（ABA响应）和CGTCA-motif（JA响应）等顺式元件（图8A）。冷胁迫下，LQ叶片内源ABA和JA含量显著升高，分别在4h和6h达到峰值（图8B-C）。使用ABA合成抑制剂FLU或JA合成抑制剂DIECA预处理，显著抑制了冷胁迫对PalBH1的诱导表达（图8H），并导致植株鲜重下降、萎蔫率升高，冷敏感性加剧（图8E-G）。这表明ABA和JA是冷胁迫下激活PalBH1转录的上游信号。
图9 ABA和JA通过PalBH1介导的ROS清除通路增强耐寒性
外源施加ABA或JA可显著减轻冷胁迫下LQ叶片DAB和NBT染色深度，降低H₂O₂、O₂·⁻和MDA含量；而使用FLU或DIECA抑制内源激素合成则加剧ROS积累和氧化损伤（图9A-E）。这些结果进一步证实，ABA和JA通过上调PalBH1表达，激活下游抗氧化系统，从而限制ROS积累，增强植株的冷适应性。
图10 PalBH1直接激活下游靶基因PaNAC019和PaHAI2的转录
qRT-PCR验证了PaNAC019、PaHAI2、PaPYL6和PaSWEET13等候选下游基因在ABA/JA处理后的表达变化（图10A-D）。双荧光素酶报告实验显示，PalBH1能够显著增强PaNAC019和PaHAI2启动子的荧光素酶活性（LUC/REN比值升高），而对PaPYL6和PaSWEET13启动子无显著激活作用（图10F-J）。这证明PaNAC019和PaHAI2是PalBH1直接调控的靶基因。
综合以上结果，提出PalBH1的作用模型：冷胁迫诱导内源ABA和JA积累，二者分别通过ABRE和CGTCA-motif协同激活PalBH1的转录；核定位的PalBH1通过激活下游靶基因（如PaNAC019、PaHAI2）及调控网络，从三方面增强耐寒性：（1）稳定光合系统（维持Fv/Fm、PIabs等）；（2）激活抗氧化酶（SOD、POD、CAT）并促进ROS清除，降低MDA；（3）促进渗透调节物质（脯氨酸、可溶性糖）积累，维持细胞膜完整性，最终提高植株冷胁迫下的存活率。
本研究首次在狼尾草中鉴定并系统解析了非典型bHLH转录因子PalBH1的冷适应功能。揭示了“冷胁迫→ABA/JA积累→激活PalBH1→上调PaNAC019/PaHAI2等靶基因→增强光合保护、ROS清除和渗透调节”的完整调控通路。同时，过表达PalBH1在显著提高耐寒性的同时不影响植物正常生长，这一特性使其在抗寒分子育种中具有独特优势。该研究为禾本科作物抗寒遗传改良提供了新基因资源和理论依据。
https://doi.org/10.1016/j.stress.2026.10144
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