东北农业大学马艳秋副教授等:蛋黄蛋白抗冻肽的制备及其对猪肉糜冻藏品质的调控

为同时解决蛋黄油副产物浪费和猪肉糜冻藏过程中抗冻保护的难题,东北农业大学的金玉昌，曹莹，刘垚彤，高鑫，杨晓雪，马艳秋等学者开发一种蛋黄蛋白抗冻肽(egg yolk protein antifreeze peptides, EYP-AFP),探究该抗冻肽在食品保鲜中的应用潜力。从脱脂蛋黄粉中提取多肽,以酵母菌存活率及水解度为指标,优化酶解条件,并评估EYP-AFP对猪肉糜冻融过程中理化性质的影响。结果表明,在先使用碱性蛋白酶(56 ℃、90 min,pH值为9,酶活力为9 890 U)后使用中性蛋白酶(45 ℃、125 min,pH值为8,酶活力为10 100 U)的条件下制备的EYP-AFP,可使冻融酵母菌存活率提高至94.44%±1.05%。将质量分数为2%、4%、6%的EYP-AFP分别加入猪肉糜内,3次冻融循环后,6%EYP-AFP组的样品解冻、蒸煮损失率分别较无添加组降低了18.3%和20.24%,保水性提高了16.53%,pH值升高了0.18。颜色、质构和电子鼻的测定结果表明,EYP-AFP可以改变肉糜颜色,降低熟肉糜的硬度、弹性、咀嚼性及内聚性,使甲基类、醇类物质和氢化物等挥发性物质增多。此外,在1次冻融循环后,6%EYP-AFP组样品较无添加组不易流动水含量提升了11.66%,自由水含量降低了11.38%;同时,微观结构分析表明,EYP-AFP可以填充在肌肉纤维束周围,使其表面结构更加致密。研究结果表明,EYP-AFP可以有效抑制猪肉糜冻融过程的组织损失、水分迁移和冰晶生长,提升肉糜持水能力,让肉糜的质地变得更为松软。研究旨在为蛋黄油副产物再利用和猪肉糜贮藏稳定性提升提供新的思路。

猪肉糜作为一种常见的肉类加工产品,其保鲜与品质维持,高度依赖于冷冻贮藏技术。然而,在反复的冻融过程中,温度的波动往往引发冰晶再结晶^[1]。这一过程会破坏猪肉糜原有的内部组织结构,导致汁液流失、营养成分损耗,最终造成产品质量显著下降^[2]。因此,有效抑制或控制冰晶的形成与生长,成为解决这一技术问题的关键。目前,食品工业中常通过添加抗冻剂来改善冷冻肉糜的品质。常见的抗冻剂包括磷酸盐类、糖类以及醇类等^[3]。然而,这些传统抗冻剂具有一定的局限性:磷酸盐虽能有效保水,但过量摄入容易在人体内与钙结合形成不溶性磷酸钙,从而影响钙质吸收^[4];糖类虽能提供良好的抗冻保护,却不利于血糖控制,对高血糖人群不友好^[5];高浓度的糖醇类物质在温度波动下,自身也可能发生重结晶,反而加剧食品质构的劣变^[6]。因此,开发更为安全、高效且具有针对性的新型抗冻技术,对于提升冷冻猪肉糜的品质与安全性具有重要意义。

近年来,抗冻肽(antifreeze peptide,AFP)作为一种新兴的生物源抗冻剂,展现出独特的应用潜力^[7-8]。AFP是一类具备冷冻保护活性的多肽分子,能以非依数性形式对冰晶进行修饰,降低冰点、抑制冰晶生长、减少冷冻损失^[9-10]。与传统冷冻保护剂相比,AFP不仅能够有效降低食品的糖分和热量,还具备来源广泛、天然安全、理化性质稳定等优势^[11]。例如,张悦悦等^[12]通过胶原抗冻肽降低牛肉饼冰点和结晶焓,使牛肉饼冻结过程中形成更加细小均匀的冰晶,降低了牛肉饼冷冻损失率。Chen等^[13]从鲢鱼鳞片中提取AFP,验证了AFP在保护鱼糜冻融稳定性的作用。Peng等^[1]从草鱼皮中提取AFP,并在冷冻鱼糜中进行应用,显著提高了鱼糜的白度,抑制了鱼糜的氧化变性,保持了鱼糜原有的空间结构。目前有关AFP制备的研究,大多以食用明胶、鱼内脏、鱼鳞等动物源或燕麦、大豆等植物源原料进行酶解,但这些原料存在一定的局限性。动物胶原蛋白水解物功能性较为单一,缺乏两亲性及乳化能力;鱼类捕捞成本较高;而植物源蛋白的热滞活性(衡量抗冻活性的关键指标)通常较低。因此,探索兼具良好抗冻活性与功能性的蛋白原料具有重要现实意义。

脱脂蛋黄粉是提取卵磷脂与蛋黄油后产生的主要副产物,常被视为废弃物。但该副产物富含蛋白质(质量分数约为75%),其组分包括低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、卵黄球蛋白及卵黄高磷蛋白等多种功能蛋白^[14]。前期研究发现,蛋黄蛋白具有优良的乳化性,且富含疏水氨基酸,经酶解暴露疏水基团,可以通过疏水相互作用抑制冰晶生长,具有开发AFP的潜在价值^[15-16]。因此,本研究拟以脱脂蛋黄粉为原料制备AFP,利用均匀实验设计优化其加工工艺,并进一步评估其对猪肉糜反复冻融过程中品质变化的影响。本研究旨在为开发健康、天然的AFP提供理论参考,同时为应对猪肉糜在冻融过程中因温度波动导致质量降低的难题提供一种新的解决方案,以符合绿色食品日益增长的市场趋势。

1.1 材料与试剂

脱脂蛋黄粉(各成分质量分数:蛋白质80.0%,脂肪3.0%,碳水化合物5.0%,水溶性维生素3.0%,灰分5.0%,水分4.0%),四川宜宾市野源植化有限公司;菠萝蛋白酶(300 U/mg)、中性蛋白酶(100 U/mg)、碱性蛋白酶(200 U/mg)、木瓜蛋白酶(800 U/mg)、胃蛋白酶(300 U/mg),上海源叶生物科技有限公司;安琪高活性干酵母(活菌数为1×10⁸个/g),安琪酵母股份有限公司;马铃薯葡萄糖琼脂(PDA),北京陆桥技术股份有限公司;新鲜高金品牌猪肉,由屠宰工人进行屠宰和分割,统一取左侧胴体的背最长肌,哈尔滨香坊区好又多超市。

1.2 仪器与设备

SJU-8D型磁力搅拌水浴锅,安徽帛月科技有限公司;THR16A型台式冷冻离心机,长沙英泰仪器有限公司;LGJ-18型真空冷冻干燥机,北京四环起航科技有限公司;BCD-610WMSA型冰箱,小米通讯技术有限公司;LRH-250型生化培养箱,上海一恒科技有限公司;TA.XT Plus C型质构仪,英国Stable Micro System公司;MesoMR23-060H-Ⅰ型核磁共振成像分析仪,苏州纽迈分析仪器股份有限公司;PEN3型电子鼻,德国 AIRSENSE公司;Sigma360型场发射扫描电子显微镜,德国 Zeiss公司。

1.3 实验方法

1.3.1 蛋黄蛋白抗冻肽的酶解工艺优化

1.3.1.1 蛋黄蛋白抗冻肽的制备

用去离子水配制0.05 g/mL的脱脂蛋黄粉分散液。调节pH值及温度,加入1×10⁴ U的蛋白酶(酶解参数,如表1～3所示)。酶解结束,于95 ℃下沸水浴10 min 进行灭酶。冷却后,6 000 r/min离心15 min,取上清液。冻干48 h并研磨后,得蛋黄蛋白抗冻肽(egg yolk protein antifreeze peptides, EYP-AFP),保存于-20 ℃冰箱中备用。

表1 不同蛋白酶水解的最适条件

Tab.1 Optimum conditions for different enzymes

1.3.1.2 酵母菌存活率的测定

酵母菌存活率是用于衡量抗冻剂抗冻活性的重要指标。酵母菌存活率的升高说明EYP-AFP可以有效抑制冰晶重结晶及生长,对应于冻融肉糜体系中的冰晶细小,从而减少肉糜汁液损失,提高持水力。酵母菌存活率与肉糜持水力之间呈正相关^[17]。称取干酵母1.0 g,分散于100 mL无菌水中,置于恒温摇床,28 ℃、120 r/min活化30 min;量取酵母菌溶液9.0 mL,分别加入1.0 mL不同质量浓度(0、40 g/L)的EYP-AFP溶液,混合均匀即为酵母菌悬液^[18]。

将酵母菌悬液进行冻融处理(-18 ℃冷冻18 h,4 ℃解冻6 h),分别移取冻融后的酵母菌液1 mL,通过10倍连续稀释法分别在马铃薯琼脂培养基培养,28 ℃条件下孵育48 h,菌落存活率按式(1)计算。

(1)

式(1)中,Y_i为第i次冻融后酵母菌菌落存活率,%;N₀为第0次冻融后酵母菌的菌落总数;N_i为第i次冻融后酵母菌的菌落总数;i=0,1。

1.3.1.3 水解度的测定

移取1.3.1.1中上清液200 μL,稀释50倍。将80 mg的邻苯二甲醛(O-phthalaldehyde, OPA)溶于2 mL无水乙醇、200 μL β-巯基乙醇、5 mL十二烷基硫酸铵(质量分数10%)和92.8 mL的四硼酸钠(0.1 mol/L)混合液,配制成100 mL的OPA溶液。取800 μL稀释液加入6 mL OPA溶液,2 min后测定A₃₄₀。按式(2)、式(3)计算水解度。

(2)

式(2)中,b(Serine-NH₂)为蛋白质中丝氨酸的NH₂质量摩尔浓度,mmol/g;b为通过甘氨酸曲线求得的NH₂质量摩尔浓度,mmol/g;V为样品中水解液体积,L;N为稀释倍数;X为样品质量,g;w为蛋白质质量分数,%。

(3)

式(3)中,h为被水解的肽键数,mmol/g;h_tot为蛋黄蛋白的肽键数,8 mmoL/g;α、β分别为1.0、0.4^[19-20]。

1.3.1.4 单一蛋白酶的筛选

经课题组前期选择,获得不同蛋白酶水解脱脂蛋黄粉的最适条件,见表1。

1.3.1.5 复合蛋白酶的筛选

由表1单一蛋白酶的酶解条件,得出复合蛋白酶的酶解条件,见表2。

表2 复合酶酶解条件

Tab.2 Enzymatic conditions of composite enzymes

1.3.1.6 均匀设计实验

根据蛋白酶及复合酶的筛选结果,选择先后使用碱性蛋白酶和中性蛋白酶进行分步酶解,对EYP-AFP的制备工艺进行优化。选取第1次酶解时温度(X₁)、pH值(X₂)、时间(X₃)、酶活力(X₄),第2次酶解时温度(X₅)、pH值(X₆)、时间(X₇)、酶活力(X₈)为影响因素,以水解度(Y₁)和酵母菌存活率(Y₂)为响应值。采用8因素12水平的均匀设计方法进行试验设计,见表3。

表3 八因素十二水平均匀设计实验

Tab.3 Balanced design experiment with eight-factor and twelve-level

1.3.2 猪肉糜的制备及冻融处理

按照Gong等^[21]的方法,略加修改。将猪肉绞碎,绞肉机的板孔直径为3 mm,将未在猪肉糜中添加EYP-AFP的实验组设为阴性对照组,将添加海藻糖的实验组设为阳性对照组(海藻糖质量分数为4%),将添加EYP-AFP的实验组设为处理组(EYP-AFP质量分数为2%、4%、6%),各组实验分别记为无添加、4%海藻糖、2%EYP-AFP、4%EYP-AFP、6%EYP-AFP。将猪肉糜置于密封袋中,所有实验组样品在-20 ℃下冷冻24 h,4 ℃下解冻24 h,为一个冻融循环(freezing and thawing cycle,F-T)。F-T过程共重复了3次,记为F-T(1～3);1、2、3次冻融循环分别记为F-T(1)、F-T(2)、F-T(3)。

1.3.3 解冻损失率的计算

参照Chen等^[22]的方法,略加修改。将猪肉糜解冻至核心温度为-1 ℃,用滤纸去除样品表面的水分。分别记录冷冻前质量和解冻样品的质量。猪肉糜的解冻损失率按式(4)计算。

(4)

式(4)中,m₀为冷冻前的猪肉糜质量,g;m₁为解冻后的猪肉糜质量,g。

1.3.4 蒸煮损失率的计算

按照Zhou等^[23]的方法,略加修改。记录猪肉糜蒸煮前质量。将样品以3000 r/min的转速离心3 min,在80 ℃条件下水浴至核心温度为70 ℃,30 min后取出,冷却至室温。猪肉糜的蒸煮损失率按式(5)计算。

(5)

式(5)中,m₂为蒸煮前的猪肉糜质量,g;m₃为蒸煮后的猪肉糜质量,g。

1.3.5 保水性测试

将蒸煮后的猪肉糜样品在4 ℃条件下冷却,精确称取1.5 g猪肉糜样品,用11 cm规格滤纸包裹,放入含适量脱脂棉的离心管中,记录离心前质量。在4 ℃条件下,离心(6 000 r/min,10 min),记录离心后质量。猪肉糜的保水性按式(6)计算。

(6)

式(6)中,m₄为离心前的猪肉糜质量,g;m₅为离心后的猪肉糜质量,g。

1.3.6 pH值的测定

准确称取3 g猪肉糜样品于15 mL(0.15 mol/L)NaCl溶液的烧杯中,3 000 r/min均质1 s,测量 pH值。

1.3.7 颜色的测定

参考Gong等^[21]的方法,略加修改。通过色度计测量猪肉糜蒸煮前后的亮度(brightness,L^*)、红绿(red-green color,a^*)和黄蓝(yellow-blue color,b^*)。色度计设置为光源D65,测量孔径为8.0 mm,视角为0°。测量前使用标准化白色背景板(L^*=95.55,a^*=-0.17,b^*=1.27)校准色度计。

1.3.8 质构的测定

将获得的熟猪肉糜,用模具切成直径为2.52 cm,高为1 cm的圆柱体,室温下使用P/36R探头进行分析。测试前、测试中、测试后的速度分别为2.0、1.0、1.0 mm/s,压缩比为40%,触发类型自动,触发力为 5 g。

1.3.9 水分分布的测定

根据Cheng等^[24]的方法,对猪肉糜中的水分分布与迁移性进行分析。磁场强度设定为0.5 T,质子共振频率为40.65 MHz。猪肉糜用保鲜膜单独包裹后置于核磁共振管中,采用单次激发法结合Carr-Purcell-Meiboom-Gill脉冲序列测定横向弛豫时间(transverse relaxation time,T₂)。

1.3.10 电子鼻风味的测定

将3 g熟猪肉糜放入20 mL玻璃样品瓶中,电子鼻测试参数设置:气流为1 L/min、清洗时间为120 s、测试时间为200 s^[25]。使用Origin 2021软件中的Principal Comment Analysis插件将测得的峰值进行PCA分析。电子鼻的10个传感器(S1～S10)分别为,W1C(芳烃化合物)、W5S(氮氧化物)、W3C(氨、芳香分子);W6S(氢化物)、W5C(烯烃,芳香族化合物,极性分子)、W1S(甲基类)、W1W(硫化合物)、W2S(检测醇,部分芳香族化合物)、W2W(芳烃化合物,硫的有机化合物);W3S(烷类和脂肪族)。

1.3.11 微观结构观察

参考Tang等^[26]的方法,并略加修改。将熟猪肉糜切成5 mm×5 mm×5 mm的块状,经固定、洗涤、梯度脱水、冷冻干燥处理后,在表面进行镀金。将扫描电子显微镜放大倍数调至200倍,观察猪肉糜的微观结构。

1.4 数据处理与分析

所有实验均重复3次,结果以平均值±标准差表示。采用SPSS 27软件对数据进行统计分析,均匀实验通过Minitab软件进行回归分析、建立模型以及方差分析,利用Origin 2021软件绘图。

2.1 EYP-AFP的制备工艺优化结果

冷冻过程中,冰晶重结晶及生长会破坏酵母菌组织结构导致其死亡。酵母菌冻融循环后的存活率是评估AFP抗冻活性的重要指标之一,因此本研究选取这一指标评估EYP-AFP的抗冻效果。水解度可以用于评定平均肽链长度,并与产物得率相关。酵母菌存活率和蛋白酶对EYP-AFP水解度的实验结果见图1。由图1(a)可知,无添加组的酵母菌存活率为59.66%±4.75%,添加不同蛋白酶制备的EYP-AFP,酵母菌存活率均有所提高,但整体不显著。其中,中性蛋白酶水解制备的EYP-AFP具有最高的酵母菌存活率,数值为81.80%±9.36%,与无添加组相比提高了22.14%。这可能是因为经中性蛋白酶酶解得到的肽段具有抗冻活性的结构域较多。碱性蛋白酶的水解度为15.87%±0.17%,高于其余蛋白酶的水解度,这可能是因为脱脂蛋黄粉中疏水芳香族氨基酸含量较高。由于中性蛋白酶酵母菌存活率最高,所以选择中性蛋白酶与其他蛋白酶复配。而后将蛋白酶进行不同方式复合使用,由图1(b)可知,先碱性蛋白酶后中性蛋白酶制备的EYP-AFP的酵母菌存活率最高,达到90.22%±1.02%,表明单一蛋白酶因为具有酶解位点特异性,存在一定局限性,两种蛋白酶复合酶解更有利于提高EYP-AFP的抗冻活性。这可能是因为蛋黄蛋白结构致密,复合酶解可以更好地使包裹在分子内部的疏水性氨基酸残基暴露在肽链表面,EYP-AFP一侧具有亲水性与冰结合,另一侧暴露出的疏水性氨基酸残基抑制冰晶生长,因而表现出更好的抗冻效果^[27],其中先碱性蛋白酶后中性蛋白酶制备的EYP-AFP抗冻活性最好。EYP-AFP对酵母菌存活率与蛋白酶水解度影响的趋势不相同,这可能是因为EYP-AFP的抗冻活性取决于特异多肽链结构域,与肽链长短无关^[11]。

不同小写字母表示组间数据差异显著(P<0.05)。

图1 EYP-AFP的酵母菌存活率及水解度

Fig.1 Yeast survival rates and hydrolysis degrees of EYP-AFP

基于本实验结果,选择先后使用碱性蛋白酶和中性蛋白酶,利用均匀实验对EYP-AFP的制备工艺进行优化。并借助Minitab软件对均匀实验所得的数据进行逐步回归,得到水解度(Y₁)和酵母菌存活率(Y₂)的回归方程,见式(7)和式(8)。

(7)

(8)

式(7)和式(8)中,X₁～X₈为优化的酶解条件,依次为第一次酶解时温度、pH值、时间、酶活力,第二次酶解时温度、pH值、时间、酶活力。利用Minitab软件进行方差分析,对所选模型进行可行性评估。回归方程的方差分析结果见表4。表4中,回归多项式的F值分别为15 599.14和233.81,这说明至少存在1个X对Y₁和Y₂有影响。此外,回归多项式的P值均小于0.01,表明模型的影响为极其显著,置信度很高,可以反映真实实验数据。

表4 回归方程的方差分析结果

Tab.4 Analysis of variance results for regression equations

“—”表示该自变量对因变量没有统计学意义上的显著影响。

为进一步提高酵母菌存活率,使用Minitab软件进行系统的优化分析,确定较佳酶解因素。由图1(c)可见,第7组的水解度最高,为23.99%±0.91%,所以在保证水解度为23.99%的基础上,以酵母菌存活率最大值作为优化目标,通过控制X₁～X₈的酶解因素,调整成整数参数,得出优化酶解条件:X₁=56,X₂=9,X₃=90,X₄=9 890,X₅=45,X₆=8,X₇=125,X₈=10 100。预测值与实际值的验证结果见表5。由表5可知,EYP-AFP水解度的实测值为23.49%±0.57%,略低于预测值。这可能是因为X₁～X₈的酶解因素经过了整数参数调整,对实验结果造成了影响,但二者之间的误差控制在3%以下,证明了模型具有较高的精度,所提出的优化方案真实可靠。先碱性蛋白酶后中性蛋白酶制备的EYP-AFP的酵母菌存活率为 90.22%±1.02%,经过工艺优化,EYP-AFP的酵母菌存活率提升为94.44%±1.05%,使复合酶冻融酵母菌的存活率提高了4.22%,达到90%以上,说明通过控制酶解过程制备出了抗冻活性较好的EYP-AFP。

表5 预测值与实测值对比结果

Tab.5 Comparison of predicted and measured values

2.2 EYP-AFP对猪肉糜解冻损失率、蒸煮损失率、保水性及pH值的影响

EYP-AFP在猪肉糜中的实际抗冻功效见图2。

不同小写字母表示组间数据差异显著(P<0.05)。

图2 F-T(1～3)过程中EYP-AFP对猪肉糜的抗冻功效

Fig.2 Freezing tolerance effect of EYP-AFP on minced pork in F-T (1～3)

2.2.1 对解冻损失率的影响

由图2(a)可见,冻融循环过程造成猪肉糜样品水分严重流失,猪肉糜样品在F-T(3)中解冻损失率为22.74%±1.75%,这可能是因为F-T(1～3)过程加剧了冰晶的形成及重结晶,对肌肉细胞造成了机械损伤,解冻后造成汁液流失和营养成分损耗^[28]。而向猪肉糜样品中添加质量分数为2%、4%和6% 的EYP-AFP,使其在F-T(3)中,与无添加组相比,解冻损失率由22.74%±1.75%分别降低为13.12%±0.24%、6.76%±0.31%和4.44%±0.40%,分别减少了9.62%、15.98%和18.30%,表明随着EYP-AFP添加量的增加,可以显著改善猪肉糜样品的水分流失。这可能是因为EYP-AFP中的亲水氨基酸结合水,从而抑制了冰晶生长并减少了水分流失^[6]。此外,与4%海藻糖组的猪肉糜样品相比,4% EYP-AFP组样品在F-T(3)中,冷冻损失率由15.65%±1.22%降低为6.76%±0.31%,降低了8.89%,这表明EYP-AFP的抗冻效果优于海藻糖。

2.2.2 对蒸煮损失率的影响

猪肉糜在蒸煮过程中,通常伴随着营养物质流失。由图2(b)可见,在F-T(3)中猪肉糜的蒸煮损失率达到34.98%±1.31%,这可能是因为F-T(1～3)过程中,由于温度波动,导致冰晶形成及冰晶重结晶现象,蛋白变性,锁水蛋白凝胶网络被破坏,使猪肉糜的蒸煮损失率增加。添加6% EYP-AFP猪肉糜样品在F-T(2)中,蒸煮损失率仅为14.74%±1.03%,与无添加组样品蒸煮损失率(34.98%±1.31%)相比,显著降低了猪肉糜的蒸煮损失率(20.24%),这可能是由于EYP-AFP中富含羟基,有助于稳定蛋白质周围的水分,促进锁水凝胶网络的形成,并增强蛋白质-水的结合能力^[29]。

2.2.3 对保水性的影响

保水性直接影响着猪肉糜的嫩度、肉质及颜色等食品感官品质。由图2(c)可见,在F-T(1～3)过程中,猪肉糜样品的保水性逐渐下降,这可能是由于冻融过程中猪肉糜内部产生的冰晶使蛋白质发生变性。向猪肉糜样品中添加质量分数为2%、4%和6% 的EYP-AFP,使其在F-T(3)中的保水性分别提高了9.55%、12.36%和16.53%。这表明,EYP-AFP的高添加量可以在蛋白质变性方面提供更有效的保护^[30],从而在冻融循环中保持了猪肉糜的保水能力,这与向冻融猪肉糜中添加EYP-AFP使解冻损失率减少的结果一致。

2.2.4 对pH值的影响

由图2(d)可见,猪肉糜样品的pH值在F-T(1～3)过程中呈现上升趋势,6% EYP组样品的pH值为6.11,经3次冻融循环提升为6.29,提高了0.18。这可能是因为,微生物利用冰晶刺破肌肉细胞渗透出营养汁液迅速繁殖,代谢产生胺类化合物等碱性含氮物质。此外,2%、4%和6% EYP-AFP组样品的pH值均高于无添加组样品,这可能是由于EYP-AFP本身的pH值在6.0～7.0,EYP-AFP与猪肉糜混合,从而使其pH值升高。

2.3 EYP-AFP对猪肉糜颜色的影响

颜色是消费者判断肉糜品质好坏的首要因素。F-T(1～3)过程中,蒸煮前、后的猪肉糜色泽变化分析结果见表6。表6显示,F-T(3)中无添加组和4%海藻糖组猪肉糜样品的L^*值分别为56.33±1.47和56.93±0.49,显著高于2%、4%和6% EYP-AFP组的猪肉糜样品。这可能是由于F-T(1～3)过程中EYP-AFP抑制了冰晶形成及冰晶重结晶,使肌肉内部形成更细腻均匀的冰晶,减少了肉表面的凝结水量,降低了表面光的反射强度,从而使亮度降低^[1]。在F-T(1～3)过程中,猪肉糜的a^*值上升,这可能是由于国际标准指南中提到的“浓缩效应”,即冻融导致的严重失水,使得单位面积内的色素密度相对上升,导致a^*值虚高^[31]。

表6 F-T(1～3)过程中蒸煮前后猪肉糜的色泽分析

Tab.6 Color analysis of pork mince before and after cooking in F-T (1～3)

不同小写字母表示组间数据差异显著(P<0.05)。

与无添加组的猪肉糜样品相比,6% EYP-AFP组的猪肉糜样品在F-T(1～3)过程中的b^*值分别提高了2.31、1.41和2.04。这可能是因为EYP-AFP中富含类胡萝卜素,高添加量的EYP-AFP与猪肉糜混合,使猪肉糜b^*升高。此外,经蒸煮后各组猪肉糜的L^*、a^*、b^*值得到了显著提高,这是因为猪肉糜内部紫红色的肌红蛋白经过加热变性后变成灰褐色的球蛋白氯化血色原。

2.4 EYP-AFP对猪肉糜质构的影响

质构特性作为猪肉糜感官品质评价的关键指标体系,直接反映猪肉糜的食用体验。在F-T(1～3)过程中猪肉糜的质构分析结果见图3。由图3(a)和图3(b)可见,在F-T(1～3)过程中,猪肉糜样品的硬度和弹性呈现下降趋势。这是因为冻融过程使脂肪和蛋白质氧化程度加剧,原本的蛋白凝胶网状结构被破坏。向猪肉糜样品中添加质量分数为2%、4%和6%的EYP-AFP,猪肉糜在F-T(3)中的硬度由(1 635.13±35.94) N降低为(1 077.43±37.52) N、(930.64±29.47) N和(585.76±28.68) N,分别下降557.70、704.49、1 049.38 N,弹性由(0.71±0.01) mm降低为(0.70±0.02) mm、(0.63±0.04) mm和(0.53±0.04) mm,分别下降0.01、0.08、0.18 mm。这可能是因为EYP-AFP是小分子水解产物,自身不具备受热形成凝胶的能力,无法参与构建并相互交联形成三维网状结构,阻隔肌球蛋白长链聚合,减弱了猪肉糜凝胶的结构强度。由图3(c)可见,在F-T(1～3)过程中,随着猪肉糜样品中EYP-AFP添加量的增加,EYP-AFP组的猪肉糜样品的内聚性呈现下降趋势。这可能是由于EYP-AFP填充在猪肉糜肌原纤维蛋白周围,在受到外力压缩时,猪肉糜内部结构的EYP-AFP部分容易发生滑移和断裂,从而导致内聚性下降。咀嚼性是硬度、弹性和内聚性的乘积。由图3(d)可见,随着猪肉糜样品中EYP-AFP添加量的增加,样品咀嚼性呈现下降趋势。这可能是因为随EYP-AFP添加量的增加,使猪肉糜样品的硬度、弹性和内聚性均下降。这些结果表明,向猪肉糜中添加EYP-AFP,可以适度降低其硬度、弹性、内聚性和咀嚼性,使猪肉糜质地更加松软,更易于咀嚼,从而更好地释放猪肉糜内部滋味。

不同小写字母表示组间数据差异显著(P<0.05)。

图3 F-T(1～3)过程中猪肉糜的质构分析

Fig.3 Textural properties of minced pork in F-T (1～3)

2.5 EYP-AFP对猪肉糜水分分布的影响

弛豫时间反映了肉糜中非流动水分的分布状态^[32]。在F-T(1～3)过程中,猪肉糜水分分布的弛豫时间与峰面积的分析结果见表7。表7显示,F-T(1)中各组猪肉糜样品均出现3个峰值,T₂₁值(0～10 ms)代表结合水,T₂₂值(10～100 ms)代表非流动水,T₂₃值(>100 ms)代表自由水。在F-T(1～3)过程中,无添加组和4%海藻糖组的猪肉糜样品的T₂₂值和T₂₃值均呈增加趋势,这表明冻融循环过程会使水的流动性增加,这可能是因为反复冻融循环会形成冰晶,破坏肌肉结构和肌纤维蛋白,降低肌肉的保水能力^[33]。向猪肉糜样品中添加质量分数为2%、4%和6%的EYP-AFP,使猪肉糜样品在F-T(1)中代表自由水的峰面积比例A₂₃值由11.48±3.17%,降低为0.72%±0.17%、0.10%±0.01%和0.10%±0.01%,分别减少了10.76%、11.38%和11.38%;代表不易流动水的峰面积比例A₂₂值由84.66%±3.08%,提升为95.57%±0.40%、95.63%±0.18%和96.32%±0.12%,分别增加了10.91%、10.97%和11.66%。这表明,EYP-AFP有效限制了水的流动,这可能是因为EYP-AFP含有更多暴露的极性残基和游离氨基酸,可以作为氢键供体结合水分并抑制水分流失^[34],A₂₂值的增加,表明EYP-AFP限制了水的流动。进而减少猪肉糜样品中的解冻损失率。此外,随着猪肉糜样品中EYP-AFP添加量的增加,EYP-AFP对结合水和非流动水向自由水迁移的抑制作用更加明显。这一效应可能归因于EYP-AFP分子中丰富的亲水基团,可以通过氢键网络特异性地与水分子相互作用^[35]。这些结果表明,向猪肉糜中添加EYP-AFP,可以抑制结合水和非流动水向自由水迁移,减少水分流失。

表7 F-T(1～3)过程中猪肉糜的水分分布弛豫时间与峰面积的变化

Tab.7 Changes in water distribution relaxation time and peak area of minced pork in F-T (1～3)

不同小写字母表示组间数据差异显著(P<0.05),“—”表示未检测到数据。

2.6 猪肉糜的电子鼻分析结果

图4展示了10个传感器对不同猪肉糜样本挥发性气味的反应雷达图及主成分分析图。由图4(a)至图4(c)可见,甲基类(W1S)、醇类物质(W2S)和氢化物(W6S)是猪肉糜中的主要气味成分。向猪肉糜中添加EYP-AFP,可以提高猪肉糜样品在W1S、W2S及W6S传感器表现的响应值,这可能是因为EYP-AFP本身富含甲基类、醇类物质和氢化物等挥发性物质^[36]。6% EYP-AFP组的猪肉糜样品对W1S传感器表现的响应值显著高于其他组别,这可能是因为甲基类化合物是肉类风味的基础组成部分,添加EYP-AFP后可以抑制甲基类化合物氧化,减少劣变醛类的产生。此外,2% EYP-AFP组的猪肉糜样品的风味轮廓与阳性对照组高度重叠,甚至在W1S传感器上略高,这说明EYP-AFP在维持肉糜风味稳定性方面具有与海藻糖相当甚至更优的效果,能够有效减缓冻融过程中的风味损失或劣变。由图4(d)可见,第一主成分区贡献率为70.3%,第二主成分区贡献率为19.6%,2个主成分区贡献率之和为89.9%,大于85%,表明这2个主成分可以用来代表F-T(1～3)过程中猪肉糜样品的整体信息。其中F-T(3)组位于第一、二象限,而F-T(2)组位于第三、四象限,二者分布在不同的区域,表明二者之间存在一定差异。此外,图中F-T(1)与F-T(2)出现部分重合,说明二者产生的挥发性气体成分相似,这与图4(a)至图4(c)的结果一致。此外,无添加组和4%海藻糖组的猪肉糜样品主要集中在PC1的负半轴,这表明海藻糖作为一种非还原性糖,在保护肉糜的过程中,基本保持了肉糜原有的挥发性风味特征,没有引入显著的额外风味。2% EYP-AFP组位于坐标轴中心附近,与海藻糖组相近,这与图4(a)至图4(c)中二者风味轮廓的高度重叠一致。4%和6% EYP-AFP组的猪肉糜样品明显向PC1的正半轴迁移,且完全脱离了对照组和海藻糖组的区域,这说明高浓度的EYP-AFP,使醇类挥发性物质增多,形成了一个独特的蛋香风味。这些结果表明,向猪肉糜中添加质量分数为2%的EYP-AFP,可以稳定猪肉糜风味,添加质量分数为4%和6%的EYP-AFP,可以形成蛋香风味。

图4 F-T(1～3)过程中猪肉糜的电子鼻及主成分分析结果

Fig.4 Results of electronic nose and principal component analysis of minced pork in F-T (1～3)

2.7 EYP-AFP对猪肉糜微观结构的影响

F-T(1～3)过程中猪肉糜的微观结构见图5。由图5可见,与无添加组和4%海藻糖组的猪肉糜样品相比,2%、4%、6% EYP-AFP组在F-T(1)过程中的猪肉糜样品的纤维束消失,且随着EYP-AFP添加量的增加,孔隙更加均匀、细小,表面结构由无序粗糙转变为有序致密。这可能是因为,EYP-AFP为小分子水解物,EYP-AFP填充在猪肉糜肌原纤维蛋白周围,这一微观结构与前文中内聚性的结果相呼应。此外,在F-T(3)中,各组的猪肉糜样品均出现了较大的孔隙,尤其是4%和6% EYP-AFP组的猪肉糜样品出现了明显裂缝。这可能是因为,猪肉糜样品受到冰晶、内源酶和氧气的影响,发生冻结和氧化变性,导致构象变化并形成多孔、低弹性的凝胶结构^[33]。这些结果表明,向猪肉糜中添加EYP-AFP,可以改善猪肉糜无序粗糙的微观结构,使其空隙更加细小,表面结构更加有序致密。

图5 F-T(1～3)过程中猪肉糜的微观结构

Fig.5 Microstructure of minced pork in F-T (1～3)

2.8 相关性分析

基于Pearson相关性分析对各指标进行评价,结果见图6。由图6可见,越接近紫色表示评价指标间正相关性越强,越接近粉色表示负相关性越强。根据文献中常选取的酵母菌质量浓度,本实验选取酵母菌质量浓度为40 g/L。此外,根据常用商业抗冻剂选取的质量分数,选取海藻糖的质量分数为4%^[37]。

图6 Pearson相关性分析结果

Fig.6 Result of Pearson correlation analysis

由图6(a)可知,X₇与Y₁,X₂与Y₂呈显著正相关,这表明第二次酶解时间是影响EYP-AFP水解度的显著因素;第一次酶解pH值是影响EYP-AFP酵母菌存活率的显著因素。由图6(b)可知,解冻损失率与蒸煮损失率呈正相关,与保水性呈负相关,相关性为极其显著。这是因为,在冻融过程中猪肉糜的肌原纤维蛋白发生蛋白质氧化,并且冰晶的形成及重结晶会对其造成机械损伤。猪肉糜的保水性与蒸煮前后的L^*值皆呈负相关,其原因可能为肉糜保水性增强,将水分包裹在内部,肉糜表面水分降低,形成的光反射强度较低,进而降低了其亮度。保水性与甲基类、醇类物质和氢化物为正相关,这可能是因为EYP-AFP富含甲基类、醇类物质和氢化物等挥发性物质,而EYP-AFP可以抑制蛋白质变性,在冻融循环中保持了猪肉糜的保水能力。此外,硬度、弹性、咀嚼性、内聚性与A₂₂呈负相关,这可能是由于EYP-AFP含有暴露的极性残基和游离氨基酸,可以作为氢键供体结合水分子,但EYP-AFP作为小分子水解物,无法交联形成三维网状结构,并且填充在肌肉纤维束周围,容易发生滑移和断裂,使硬度、弹性、咀嚼性、内聚性降低。

本研究利用蛋黄油提取过程中产生的副产物——脱脂蛋黄粉酶解制备高活性抗冻肽,酶解优化后的条件:先碱性蛋白酶(56 ℃,90 min,pH值为9,酶活力为9 890 U)后使用中性蛋白酶(45 ℃,125 min,pH值为8,酶活力为10 100 U)。此条件下制备的EYP-AFP可使酵母菌存活率提升至94.44%±1.05%。将EYP-AFP添加入猪肉糜中,可以有效抑制在冻融循环过程中猪肉糜内部冰晶的形成和重结晶现象,进而降低解冻损失率和蒸煮损失率,提升其保水性及pH值,降低样品L^*值,提高b^*值,并减少结合水及非流动水向自由水迁移,形成更加致密的表面结构。此外,EYP-AFP还可以降低熟制猪肉糜的硬度、弹性、咀嚼性、内聚性。该质构改良作用有助于提升产品适口性,尤其利于咀嚼功能受限或消化能力较弱的婴幼儿及老年群体。将EYP-AFP作为一种新型天然抗冻剂,可同时解决蛋黄油副产物的资源浪费和猪肉糜冻融过程中抗冻保护的问题。希望本研究可为高生物活性抗冻肽的制备及其在冷冻食品体系中的功能化应用提供技术参考。

参考文献：略

引用格式：金玉昌,曹莹,刘垚彤,等. 蛋黄蛋白抗冻肽的制备及其对猪肉糜冻藏品质的调控[J]. 食品科学技术学报,2026,44(1):151-166. JIN Yuchang, CAO Ying, LIU Yaotong, et al. Preparation of egg yolk protein antifreeze peptides and their regulation of frozen quality in minced pork[J]. Journal of Food Science and Technology, 2026,44(1):151-166.

制作：赵宇飞

编辑：李宁

审核：叶红波 张逸群