《食品科学》:中国农业科学院张书文研究员、天津科技大学李红娟副教授等:乳清蛋白热稳定性改性技术及评价研究进展

乳清蛋白是奶酪加工产生的副产物乳清液中的主要成分，其组成主要包括β-乳球蛋白（β-Lg）（约3.2 g/L）、α-乳白蛋白（α-La）（约1.2 g/L）、牛血清白蛋白（BSA）（约0.4 g/L）以及免疫球蛋白（约0.7 g/L）等。根据乳清蛋白制备工艺的不同可以将其分为两大类产品，乳清浓缩蛋白（WPC）和乳清分离蛋白（WPI）。由于丰富的氨基酸组成和易于人体吸收的特性，乳清蛋白被视为高品质蛋白质。随着人们对乳清蛋白营养价值的认知提升，以及改善功能特性的技术进步，商业乳清蛋白配料的应用需求持续增长。乳清蛋白配料被广泛应用于多种产品，包括强化乳清蛋白的运动食品、功能食品及特医食品。但由于乳清蛋白自身性质不稳定，经80 ℃以上的热处理后会导致其变性和聚集，并且在足够高的蛋白质含量（通常超过8%～10%的蛋白质）下，它们往往会形成热诱导凝胶。虽然乳清蛋白的凝胶性在许多产品中被广泛应用，但在高蛋白液态饮料中不适用。由于热稳定性差，经超高温（UHT）瞬时灭菌后乳清蛋白在饮料中会出现沉淀、聚集、絮凝等现象，从而影响产品的稳定性和品质。

近年来，乳清蛋白强化运动食品、特医食品、保健食品等含有高蛋白（乳清蛋白相对含量＞10%）的功能性饮品需求逐年增加。为了制备稳定性好的高蛋白饮料，需对乳清蛋白进行改性以提高其热稳定性。中国农业科学院农产品加工研究所的董暄、张书文*，天津科技大学食品科学与工程学院的李红娟*等人综述国内外机构对乳清蛋白热稳定性改性技术的研究进展，并对其应用前景进行总结，提供评价乳清蛋白热稳定性和变性程度的多个指标，旨在为提升乳清蛋白的应用性和经济效益提供参考价值。

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乳清蛋白的热稳定性及变性机制

1.1 乳清蛋白的热稳定性

热稳定性是指物质在相对较高的温度条件下抵抗其化学结构或物理形态发生不可逆变化的能力。乳清蛋白的热稳定性主要表现为在高温处理过程中抵抗聚集体产生的特性。乳清蛋白溶液经80 ℃以上的热处理会导致蛋白变性和聚集，并且在高蛋白质浓度条件下，它们往往会发生热凝聚。虽然乳清蛋白在许多产品（如奶酪、冰淇淋、布丁或酱汁）的应用中需要聚集和凝胶化，但在高蛋白饮料中不适用。将乳清蛋白复配制备的高蛋白饮料进行UHT处理，若出现凝聚现象会直接影响产品的口感和品质。

乳清蛋白中各组分的变性温度分别为α-La 62 ℃、β-Lg 78 ℃、免疫球蛋白72 ℃、BSA 64 ℃。β-Lg是乳清蛋白中含量最多的组分（表1）。因此，乳清蛋白的聚集通常被认为是由β-Lg驱动的。β-Lg在可承受的温度范围内保持二聚体的天然构象，在处于温度的临界值时蛋白就会发生变性，变性后的β-Lg天然构象发生改变，多肽链的三级结构被破坏，发生去折叠，使包埋在球状结构内部的疏水侧链基团暴露出来。暴露的巯基可与乳清蛋白内部的其他蛋白结合形成聚集体，从而反映乳清蛋白的热稳定性。

1.2 乳清蛋白的变性机制

乳清蛋白的天然结构依靠以下作用力维持：氢键、疏水相互作用、离子键、二硫键。如图1所示，当这些作用力被破坏时，蛋白质从紧密的天然构象（折叠状态）变为松散的无序结构（展开状态），致使乳清蛋白的物理性质改变，暴露出内部的疏水基团或活性位点，功能特性发生改变。若仅非共价键被破坏，去除变性条件后可能复性，若二硫键重组或发生聚集，则无法恢复天然状态。乳清蛋白变性是分子结构从有序到无序的转变，主要由热、化学或机械作用驱动。乳清蛋白变性过程中会释放含硫小分子化合物（如硫化氢和甲硫醇），这些强风味物质会导致加热含乳清蛋白的产品时产生蒸煮味。一般而言，乳清蛋白聚集涉及游离巯基基团与含胱氨酸蛋白质中二硫键的巯基和二硫键发生互换作用。这些蛋白质之间的相互作用会导致乳清蛋白不可逆地聚集成不同大小的蛋白质复合物，具体大小取决于加热条件和蛋白质组成等因素。

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影响乳清蛋白热聚合的因素

2.1 蛋白浓度

乳清蛋白变性程度受蛋白质浓度的影响。乳清蛋白中主要组分BSA、免疫球蛋白、β-Lg和α-La的变性速率随着总蛋白浓度的增加而增加。Iametti等发现，通过将β-Lg的质量浓度从3.8 mg/mL增加到16 mg/mL，在加热过程中可以促进多聚体物质的形成。Buggy等在pH值为6.2、6.7、7.2条件下对1%、4%、8%和12%的WPI溶液进行85 ℃热处理30 s，加热后与较低含量乳清蛋白溶液相比，含12%的乳清蛋白溶液在每个pH值条件下明显具有更高的表观黏度。因此，改变乳清蛋白的浓度，在一定程度上可以影响乳清蛋白的变性聚集。

2.2 温度

球状乳清蛋白的变性通常有两个过程，分为可逆过程和不可逆过程。当温度最初升高到65 ℃时，球状蛋白质结构展开，这个过程是可逆的。但当温度超过70 ℃时，会发生不可逆的聚集，通常是由于巯基或二硫键交换引起的游离巯基和含胱氨酸的蛋白质发生了聚集反应。刘芙蓉等研究发现，与60 ℃相比，热诱导温度为85 ℃更能促使WPC分子充分展开，从而使分子间的疏水相互作用、氢键与二硫键作用增强，形成致密的乳清蛋白聚集体。王晶等在80、85、90、95 ℃不同温度条件下加热3%的WPC 10 h，乳清蛋白在80 ℃完全变性，随着热处理温度升高，聚合程度也在逐渐增大。

2.3 pH值

pH值是调控蛋白质表面电荷分布的关键因素，可用于控制热诱导乳清蛋白的变性或聚集行为以及它们之间的相互作用。在乳清蛋白等电点（pH 4.6）下，变性程度随加热时间的延长而增加，通常表现为免疫球蛋白＞BSA＞β-Lg＞α-La。有研究证明在pH值为6.0～8.0范围内，乳清浓缩蛋白的热稳定性均随着pH值的增大而有所提高，pH值越大，WPC越不容易发生变性。Jung等发现在pH 2.0条件下变性导致β-Lg形成棒状聚集体，而在pH 5.0条件下，即接近β-Lg的等电点时，观察到高分子质量球形聚集体的形成。

2.4 盐离子

盐离子的存在会加速蛋白质的聚集反应。主要原因如下：1）盐离子对蛋白质负电荷具有静电屏蔽作用，从而有利于疏水键介导的聚集；2）由于盐离子诱导的构象变化引起特异性疏水相互作用；3）通过与蛋白质形成盐桥使相邻蛋白质分子发生交联。含有盐离子的化合物种类有很多，包括氯化钠、氯化钙、磷酸钠等多种类型。Du Qiwei等研究了Ca²⁺对高热量乳清蛋白乳液热稳定性和流变性的影响，发现增加Ca²⁺会降低乳液的稳定性，121 ℃加热后使乳液中的絮凝现象加剧。Vardhanabhuti等也探究了硫酸葡聚糖、NaCl和初始蛋白质浓度对β-Lg和α-La热诱导聚集的影响，发现NaCl的存在会导致聚集体显著增加。盐离子浓度同样也会对蛋白的热聚合行为产生影响，浓度越高聚集程度越大。Kawakami等研究得出在0.01%或更低的离子强度下经65～90 ℃热处理后，乳铁蛋白保留了85%以上的铁结合能力，而离子强度为0.1%时，铁结合能力随温度升高而显著降低。

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乳清蛋白热稳定性改性技术及应用

3.1 物理改性

3.1.1 微粒化蛋白

乳清蛋白的微粒化已被证明可以产生具有热稳定性的微聚集体。如图2所示，微粒化通常是通过热聚集或酸沉淀实现的，通过结合高剪切和高压处理。微粒化乳清蛋白可被视为一种由天然蛋白质与特定粒径蛋白质聚集体共同构成的混合物，在一定程度上可以防止乳清蛋白在加热状态下发生聚集。Havea等早在2012年就申请获得了制备热稳定型微粒化乳清蛋白的专利。Çakir-Fuller利用微粒化乳清蛋白制备了蛋白质浓度高达11%的乳液，并证实其经高温蒸煮后无可见聚集或胶凝，显示出良好的热稳定性。同样，Sağlam等使用两步乳化法和热诱导凝胶化的组合制备得到乳清蛋白，改善了颗粒的溶胀率，增加了乳清蛋白溶液的稳定性。Allahdad等在不同pH值条件下制备了鸡蛋和乳清蛋白混合颗粒，结果表明，在pH值为5.0和6.0时生成的颗粒由于球形形态而表现出小于1 000 cP的黏度，由微粒化蛋白制备的高蛋白乳液经巴氏杀菌后形成了具有适当黏度的热稳定性乳液。目前，市场上有多种不同功能特性的微粒化蛋白，其中菲仕兰旗下的Nutri Whey^TM ProHeat、CP Kelco推出的SIMPLESSE^® 100以及恒天然推出的WPC 550和WPC 515均具有优异的耐热特性，微粒化蛋白具有成熟的加工工艺，已经广泛应用于高蛋白饮料中。

3.1.2 超高压处理

施加压力对乳清蛋白分子内疏水和静电相互作用有破坏作用。由于氢键相互作用对压力不敏感，因此高压会破坏球状蛋白的四级和三级结构，而对其二级结构的影响较小。高压处理对乳清蛋白的影响已在多项研究中得到证实。Dissanayake等将质量分数10%的乳清蛋白在90 ℃条件下热处理20 min，并在140 MPa条件下微射流处理5 次后，其热凝固时间从14.5 s延长至102.5 s。超高压技术通常很难以单一作用提高乳清蛋白的热稳定性，往往是与其他方法复配，协同提高乳清蛋白的热稳定性。

3.1.3 超声波处理

超声波作为一种新型的蛋白改性技术，具有较为广泛的应用前景。超声波可分为低频（20～100 kHz）高强度超声和高频（100 kHz～1 MHz）低强度超声两种。其中高强度超声主要用于食品改性，超声波对食品系统的基本影响归因于空化和微流化。Khatkar等在最大净功率为750 W、频率为20 kHz、振幅为20%的条件下对WPC溶液进行超声处理20 min并喷雾干燥，得到的改性蛋白粉具有更好的热稳定性。Ashokkumar等观察到，将4%～15%乳清蛋白溶液预热至80 ℃后，在20 kHz条件下进行短时间超声处理，经过超声改性后的样品在80 ℃加热20 min不发生凝胶现象。物理改性方法因操作简单、效果好，制备得到的乳清蛋白安全无添加剂，易被市场和大众认可，是安全可靠的改性方法。

3.2 化学改性方法

3.2.1 螯合反应

蛋白质的化学修饰是通过改变蛋白质的二级、三级和四级结构或改变疏水蛋白与亲水蛋白的比例实现的。可通过添加防止蛋白质聚集的化合物提高蛋白质的热稳定性，例如二氢硫辛酸（DHLA）或N-乙基马来酰亚胺（NEM）等。这些化合物通过阻断反应性巯基（—SH）以改善β-Lg的热稳定性，从而抑制蛋白质在加热时发生聚集。Wijayanti等研究了—SH试剂对WPI热聚集反应的影响，结果发现NEM可减少乳清蛋白中间聚集体（如二聚体、三聚体和四聚体）的形成。Hebishy等在加工前添加钙结合盐（CBS），通过结合Ca²⁺提高WPI的热稳定性，从而减少热处理过程中发生的变性沉淀。Rasouli等报道了六偏磷酸钠（SHMP）在预防蛋白质变性方面的潜在能力，在低甲氧基果胶（LMP）和i-角叉菜胶存在下，通过添加最佳比例的SHMP，蛋白质变性被延迟，可以保持WPC溶液的稳定性。

3.2.2 糖基化反应

糖基化改性是将不同分子质量的糖类化合物与乳清蛋白作为底物，在一定的条件下进行热处理，热处理过程中糖类化合物与蛋白质结构中的α-或ε-氨基以共价键相结合形成糖基化蛋白。根据反应条件的不同将其分为干法糖基化和湿法糖基化。郑喆等通过美拉德反应制备出乳清蛋白-葡萄糖共价复合物，在蛋白质与葡萄糖质量比1∶6、反应温度60 ℃、反应时间48 h的条件下，乳清蛋白的热稳定性得到有效提升。Zhou Zhengtao等研究了不同pH值条件蛋白质与壳聚糖的相互作用及其对蛋白质热变性的影响，在pH 4.0时，少量壳聚糖能够防止乳清蛋白分子的热诱导变性和聚集；在pH值为5.5时，壳聚糖-乳清蛋白复合物提高了分散体的热稳定性，并且在20 d内没有检测到沉淀。Qin Xinguang等在干燥状态下使用麦芽糖糊精（MD）和乳清蛋白进行糖基化反应，最终得到的糖化乳清蛋白溶液在接近等电点的条件下于88 ℃加热2 min后，溶液仍保持透明。Setiowati等通过在温度60 ℃和相对湿度74%条件下干热处理制备WPI与LMP缀合物，从而大大提高了WPI的热稳定性。He Yue等通过将质量比为1∶1～6∶1的WPI-菊糖混合溶液冷冻干燥后加热，结果表明，添加菊粉使WPI的变性温度从68 ℃提高到85 ℃。

3.2.3 其他化学反应

一些化学方法通过添加不同的化合物与乳清蛋白发生络合反应，维持乳清蛋白的天然构象或引导其形成可控聚集体，从而在热处理中保持功能特性。Sutariya等将H₂O₂加入12.8%的WPI溶液进行热处理，当H₂O₂浓度大于0.072 mol/L时减少了WPI的热变性和聚集，改善了其热稳定性。Fei Xiaoyun等将浓度为2～10 mmol/L的没食子酸（GA）/原儿茶酸（PA）与乳清蛋白共价结合，形成的PA/GA-乳清蛋白共价复合物使蛋白变性温度提高了1.95～19.87 ℃。Capitani等通过将β-Lg和α-La与羧甲基纤维素选择性络合，从而将蛋白质分子固定在复合物中，使乳清蛋白的热稳定性提高了大约6～8 ℃，将α-La的热稳定性提高了大约26 ℃。化学改性方法效率高，但所添加的化合物可能存在法规限制，其残留可能引发安全顾虑，因此较难被消费者广泛接受。

3.3 酶法交联

微生物酶已被广泛用于交联蛋白质，导致聚合和凝胶化。然而，酶也被用于修饰乳清蛋白的热稳定性。目前用于提高WP热稳定性的酶主要是转谷氨酰胺酶（TGase），TGase能够特异性地作用于谷氨酰胺和赖氨酸，而过氧化物酶、酪氨酸酶等的作用依赖于酪氨酸，反应过程易生成高活性的、不受控的自由基或醌，可能导致副反应。无论是否存在还原剂，乳清蛋白与TGase的孵育时间都极大地影响了蛋白质的热稳定性。在37 ℃、pH 7.4、50 mmol/L NaCl、5 mmol/L NaN₃、20 mmol/L二硫苏糖醇（DTT）的条件下，将质量分数5%的β-Lg溶液与TGase孵育不同时间，其热稳定性随孵育时间呈现差异性变化。由于乳清蛋白的球状结构，乳清蛋白与TGase的交联反应往往较弱。如图3所示，乳清蛋白通常需展开以促进与TGase进行交联。Zhong Qixin等报道了TGase处理预热乳清蛋白溶液对其热稳定性的影响，发现在用TGase处理前，先将质量分数5%的WPI溶液在pH 7、80 ℃条件下预热15 min，显著提高了WP的耐热性。Damodaran等同样研究发现，将质量分数5%的WPI溶液在70 ℃、pH 2.5条件下分别热处理1、5、10 min后，再经TGase处理，可使β-Lg的热变性温度升高约13～15 ℃。酶法交联虽改性效果好，但添加酶会提高改性乳清蛋白的成本，这对于普通产品生产企业可能难以承受，很难大规模投入使用。

3.4 分子伴侣

O’Kennedy等研究了分子伴侣在防止乳清蛋白发生不可逆热聚集方面的作用。分子伴侣是指能够协助其他蛋白质进行非共价折叠或组装，并防止其发生错误聚集的一类蛋白质。其主要生物学功能在于维护其他蛋白质的功能性构象。蛋白质折叠易受热扰动，在极端热处理下会发生变性或去折叠，而添加外源分子伴侣可能有助于缓解这一过程引起的结构损伤。Chevallier等将含有乳清蛋白与酪蛋白的分散体在85 ℃加热诱导聚集后，通过超滤获得了小聚集体，该聚集体能有效提升高浓度乳清蛋白乳液的热稳定性。Singh等研究了不同比例酪蛋白与乳清蛋白制备的高蛋白乳液在UHT处理下的稳定性，发现酪蛋白的加入增强了乳清蛋白对UHT处理的耐受性，使质量分数10%的蛋白溶液能够稳定进行UHT加工。添加分子伴侣有助于在热处理中更好地维持乳清蛋白的天然构象与功能特性。然而，引入外源蛋白可能引发消费者的接受度问题，且该技术目前的产业化成熟度仍有待提高。

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表征乳清蛋白变性和聚集的评价指标

4.1 光谱学

4.1.1 浊度（紫外-可见光谱）

浊度法操作简便，但能直观地反映乳清蛋白的变性与聚集程度。在乳清蛋白变性和聚集后，粒径的增加会改变光的散射和透射率。这通常会使蛋白质溶解度降低、蛋白溶液的浊度增大，其变化可通过420 nm波长处的透射率（或吸光度）进行量化。尽管样品浊度变化可以提供乳清蛋白变性或聚集的信息，但这仅仅是一个初级指标，仍然需要更高级的分析辅助验证。用于乳清蛋白变性和聚集的浊度分析也受其他条件的限制，如被分析样品的状态必须与其他样品组分的基质一样，或对其进行预处理（过滤或离心），否则该技术得到的结果无法作为参考。

4.1.2 傅里叶变换红外光谱（FTIR）

FTIR可以提供乳清蛋白二级结构的信息，通常使用400～4 000 cm^-1波数范围。在曝光过程中，样品会吸收一部分光，一旦光频率与样品中化学键（即C—H、N—H、O—H、S—H）的振动频率相匹配，就会引起分子振动（即拉伸、摇晃、弯曲）。该技术通过测量样品中天然乳清蛋白的水平，能够准确可靠地评估乳清蛋白变性程度。由于乳清蛋白是高度有序的球状蛋白，因此它们具有α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲结构。乳清蛋白变性或聚集引起的分子断裂和重新排布会使蛋白质的二级结构发生变化。FTIR通过让红外光穿过蛋白质样品，并测量其在特定频率或波数范围内的吸光度变化，从而分析蛋白质的这些变化。乳清蛋白红外光谱中的主要目标区域是酰胺I带和酰胺II带。酰胺I带主要由C＝O键拉伸产生，而酰胺II带由N—H键弯曲和C—N键拉伸产生。这些条带的确切频率取决于所研究蛋白质的二级结构。FTIR可用于分析液体或固体形式的乳清蛋白，并能结合加热条件，在不同温度条件下进行测量，从而实现对蛋白质变性与聚集过程的动态监测。

4.2 直观分析方法

4.2.1 热絮凝时间（HCT）法

HCT法是通过观察乳清蛋白溶液在加热过程中聚集体的形成情况，研究热处理对蛋白变性聚集的影响。该方法简单且具有直观性，可以快速评估乳清蛋白的热稳定性以及比较不同样品在相同加热时间下的聚集程度。HCT指标在评估乳清蛋白的热稳定性中具有普遍性。李妍等利用HCT法证实了经磷酸化修饰的WPC经过较长时间的加热才发生絮凝，显著提高了乳清蛋白的热稳定性。HCT法除了用于监测乳清蛋白的变性和聚集情况，也可以用于评价乳液的热稳定性。但该方法仅能初步评定乳清蛋白的热稳定性，对变性程度以及加热过程中内在机理的变化无法进行准确分析，仍需要其他指标进一步分析。

4.2.2 加热后离心沉淀率法

加热后离心沉淀率法是通过对热处理后的乳清蛋白溶液进行离心，根据沉淀物质量计算得出结果的方法。该方法操作方便且无需特定的实验设备即可快速鉴定乳清蛋白的聚集程度，在该方法中可以灵活调节样品的浓度以及加热温度，测定的结果具有可靠性。然而，该方法仅能表征蛋白质的宏观聚集程度，无法确定具体的变性程度、变性温度及结构变化等细节，具有一定的局限性。因此，常将其作为初步评估乳清蛋白热稳定性的指标，再辅以其他更为精密的检测手段进行深入分析。

4.3 差示扫描量热（DSC）法

DSC法是一种通过测量热流差异研究乳清蛋白变性或聚集的热分析技术。其核心原理在于蛋白质样品与参比溶液在加热过程中所需的热量不同。实验时，将二者在量热仪中缓慢加热至目标温度（通常低于140 ℃），并实时记录使它们保持同温所需的热流。在此过程中，乳清蛋白的变性（吸热）与聚集（放热）会分别导致热谱图上出现吸热峰或放热峰。此外，由于溶液中的乳清蛋白在折叠与未折叠状态间存在动态平衡，变性过程即体现为此平衡的移动。对这些峰的起始温度、峰值温度和峰面积进行分析，可获得变性温度、变性焓等信息。乳清蛋白对热非常敏感，通常在低于100 ℃的温度范围内可观察到吸热变性峰。而聚集过程伴随的放热峰常因与变性吸热峰重叠而难以被单独检测。传统DSC法通常需要较高的蛋白质浓度以获得可靠信号，而对于稀溶液，则需使用灵敏度更高的微量或纳米量热仪。

4.4 粒径分析

粒径分析主要基于光散射原理，可分为静态光散射（SLS）和动态光散射（DLS）两种技术。SLS通过测量样品在0°～180°范围内多个角度的散射光强度计算颗粒粒径。其原理在于，粒径不同的颗粒具有不同的散射模式：大颗粒的散射光强度在前向（小角度）更为集中和强烈；而小颗粒的散射光强度则在不同角度分布得更为均匀，角度依赖性较弱。在分析时还需设定颗粒的折射率。DLS的测量需要将探测器固定在设定的角度检测粒子的随机布朗运动，随着时间的推移，散射光强度会发生波动。这两种光散射技术都广泛用于分析天然和聚集形式的乳清蛋白。DLS适用于测量天然蛋白或较低分子质量的可溶性聚集体。但高浊度样品通常需要稀释，可能改变蛋白质环境（如离子强度、pH值）进而影响粒径。SLS则更适用于测量较大的聚集体（＞1 μm），其多角度检测器能有效量化强散射信号。Torres等使用SLS表征两种乳清蛋白微粒，发现较大的颗粒（55.3 μm）在凝胶网络中的参与程度低于较小颗粒（13.8 μm）。

4.5 流变学分析

流变学分析可通过测量表观黏度确定乳清蛋白的聚集状态。乳清蛋白的变性和聚集导致颗粒大小、密度和体积增加，从而引起体系黏度上升。Marcelo等通过测量表观黏度比较了天然样品与商业化WPI和WPC的特性，发现天然样品的黏度和流动活化能较低，这与其中天然蛋白质含量较高相关。Murphy等也研究了黏度与乳清蛋白变性之间的相关性，使用高浓度蒸汽喷射工艺替代传统管式换热器，与高浓度蒸汽喷射工艺相比，使用传统管式换热器进行预处理后，乳清蛋白变性程度增加，显示出更高的黏度。Joyce等的研究指出，对WPI溶液进行高温短时处理时，聚集作用对黏度的影响大于变性作用。然而，由于样品在采集与分析过程中可能发生物理化学变化，获取准确的单点黏度数据存在一定困难。

4.6 乳清蛋白氮指数（WPNI）法

WPNI法最初是为分类喷雾干燥脱脂奶粉的热处理程度而开发的。样品中天然乳清蛋白的水平可以通过凯氏定氮法或WPNI方法测定。WPNI方法利用饱和氯化钠溶液对酪蛋白和变性乳清蛋白进行盐析沉淀，只保留天然乳清蛋白，然后加入HCl引起浊度变化。使用低温和高温分类的脱脂奶粉样品建立标准曲线，其中，相关样品分为低热（＞6.0 mg/g）、中热（1.5～6.0 mg/g）或高热（＜1.5 mg/g），乳清蛋白含量以每克脱脂奶粉中的天然乳清蛋白质量表示，单位为mg/g。与凯氏定氮法繁琐的氮气消化/蒸馏相比，WPNI方法更快捷，但其无法提供有关乳清蛋白变性状态或聚集体粒径的信息。

4.7 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）

SDS-PAGE可根据分子质量分离蛋白质，具有良好的分辨率和可靠性。SDS是一种阴离子表面活性剂，可以使蛋白质二级和三级结构改变，能使蛋白质变性并均匀带上负电荷。在电场作用下，蛋白质根据分子质量大小在凝胶中迁移得以分离。通过使用已知分子质量的标准蛋白作为参照，可以估算样品蛋白的分子质量。虽然SDS-PAGE是一种定性技术，但该方法可以用于评估乳清蛋白聚集的程度和类型。在电泳分析中，还原剂通过破坏蛋白质聚集体中的分子间或分子内二硫键，使其解聚，从而可用于评估蛋白质的聚集程度。Anema等利用SDS-PAGE测定加热和未加热牛奶样品中的天然乳清蛋白含量，并证明酪蛋白胶束的大小受乳清蛋白-κ-酪蛋白结合的影响，导致加热牛奶样品中可溶性乳清蛋白水平降低。该技术的局限性是无法分离大分子质量聚集体（＞250 kDa），因为它们无法通过凝胶迁移。乳清蛋白变性和聚集的评价指标如表2所示，可根据各个指标的优缺点选择最适宜的检测方法。

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结 语

乳清蛋白具有独特的营养和功能特性，使其成为一类特殊的食品配料。其应用不仅基于多样的功能特性，还得益于高营养价值、合理的成本及公认安全的认证。但乳清蛋白具有热不稳定性，热处理会使蛋白发生变性、聚集，并在某些条件下形成凝胶，这主要归因于以下两个机制：原先包埋的非极性基团暴露；通过活化巯基使硫醇和二硫键发生交换反应。为抑制热处理过程中乳清蛋白的变性与聚集，并制备热稳定型乳清蛋白产品，目前已采用多种技术手段，包括微粒化、高压处理、超声处理等新型物理方法，TGase处理以及添加螯合剂、碳水化合物、H₂O₂等化合物提高乳清蛋白的热稳定性。而在工业实际应用中需考虑方法的经济性、安全性、实用性，TGase处理虽效果好，但成本较高，限制了其在普通产品中的大规模应用。而添加螯合剂和H₂O₂等化合物存在一定的法规风险，H₂O₂残留可能引发安全问题，部分化合物国家标准限量严格，很难被大众接受。基于物理改性的设备虽初期设备投入较大，但运行成本低，适合规模化生产。微粒化工艺因操作简单、效果好、制备得到的乳清蛋白安全无添加剂，已被市场和大众认可，并且该技术是一项绿色可持续改性技术，可以将其他食品加工业的副产物进行功能改良，变废为宝。目前已经有市售的热稳定型乳清蛋白微粒应用于高蛋白饮料当中，微粒化乳清蛋白有望超越传统饮料范畴，可应用于特医营养品、低脂高蛋白乳制品、3D打印食品等方面，在未来具有广阔的应用前景。

第一作者：

董暄 硕士研究生天津科技大学食品科学与工程学院

2023.09-至今：天津科技大学硕士研究生在读；2024.03-至今：中国农业科学院农产品加工研究所进行联合培养，完成课题研究。硕士期间研究方向为乳品加工与品质调控。

引文格式：

董暄, 逄晓阳, 路茹青, 等. 乳清蛋白热稳定性改性技术及评价研究进展[J]. 食品科学, 2026, 47(2): 357-365. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250828-189. 

DONG Xuan, PANG Xiaoyang, LU Ruqing, et al. Research progress on the improvement and evaluation of the heat stability of whey protein[J]. Food Science, 2026, 47(2): 357-365. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250828-189. 

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