材料与方法
细菌菌株与土壤微宇宙实验：选用Glutamicibacter nicotianae OTC-16（CGMCC 15055）作为四环素降解菌，其基因组包含1条染色体和4个质粒。实验设置两种土壤：背景抗性组较简单的红壤（Soil A，含62-87个ARGs，酸性）和背景抗性组复杂的潮土（Soil B，含204-212个ARGs，近中性pH）。实验分为8周接种期（每周添加10 mg/kg OTC和/或约10⁷ CFU/mL的OTC-16菌液）和24周恢复期，设Control、+OTC、+Strain、+OTC+Strain四个处理，每个处理3次重复，土壤含水量维持在50%田间持水量。
高通量qPCR及数据分析：采用Wafergen SmartChip Real-time PCR系统，使用376对引物检测ARGs和移动遗传元件（MGEs）。ARGs相对丰度通过靶标基因拷贝数与16S rRNA基因拷贝数的比值计算，抗性组库大小为所有检测到的ARGs亚型相对丰度之和，库丰富度为通过质量控制的亚型数量。抗性组扩张以各处理ARGs（或MGEs）相对丰度总和与对照的比值表示，基因i对扩张的贡献按公式Ci=(Ai,trt - Ai,CK)/∑(Ai,trt - Ai,CK)计算（仅考虑Ai,trt > Ai,CK的基因）。
ARG稳定性及残留DNA持久性测试：通过连续传代实验（20次转移，设无抗生素、1 mg/L OTC、100 mg/L OTC三个处理）评估OTC-16中ARGs的遗传稳定性，采用平板计数法测定抗性表型稳定性，qPCR定量ARGs拷贝数。利用叠氮溴化丙锭（PMA）处理结合qPCR区分活性细胞DNA与残留DNA，残留DNA丰度为总ARGs丰度与活性细胞ARGs丰度之差，残留DNA比例为（总 - 活性）/总。
四环素降解菌基因组分析：系统检索获得26株四环素降解菌的全基因组序列，使用Mashtree构建系统发育树，ABRicate（80% identity和80% coverage）注释ARGs，ISEScan和IntegronFinder识别插入序列和整合子，Platon和oriTfinder2分析质粒及转移相关元件。
结果
接种引发土壤抗性组持续扩张：OTC-16在两种土壤中均加速了OTC的消散，但导致抗性组持续扩张，尤其是在背景抗性组简单的Soil A中。+OTC+Strain处理下，Soil A在恢复期16周时ARGs和MGEs相对丰度分别为对照的23倍和41倍，Bray-Curtis PCoA显示其抗性组组成与对照差异显著；而背景抗性组复杂的Soil B抗性组扩张较弱，但所有处理的抗性组结构改变均持续存在。
非靶标ARGs主导抗性组持续扩张：OTC-16基因组含9个ARGs和21个MGEs，包括靶标四环素抗性基因tet(33)和8个非靶标ARGs（如sul1、qacEΔ1等）。尽管存在OTC暴露，两种土壤中28个四环素ARGs池的丰度在16周时均净减少，tet(33)在8周内降至背景水平；而sul1、qacEΔ1等非靶标ARGs在接种处理中持续富集，成为抗性组扩张的主要驱动因素。Soil A的抗性组扩张主要由接种菌源的非靶标ARGs和相关MGEs（如IS6100、tnpA-2）驱动，Soil B则还涉及本土非四环素抗性组的增加。
接种菌定殖差异影响抗性组：通过菌株特异性染色体标记novel2追踪发现，OTC-16在Soil A中成功定殖，16周时占Glutamicibacter种群的50-59%，宏基因组测序显示其染色体和所有质粒均有覆盖；而在Soil B中未能持续定殖，16周时仅检测到质粒pGnD9（可能为本土共有移动元件）。偏最小二乘路径模型（PLS-PM）证实，Soil A中接种菌定殖对抗性组有显著直接和间接影响，而Soil B中抗性组扩张主要由其他机制驱动。
靶标与非靶标ARGs的差异化持久性：追踪5个质粒携带的ARGs发现，靶标ARG tet(33)和非靶标ARG cmx在两种土壤中迅速清除，而sul1、qacEΔ1、dfrA1等非靶标ARGs持续存在，24周时仍显著高于对照。连续传代实验表明，无抗生素条件下OTC-16的OTC抗性表型不稳定，10次转移后仅1.9%细胞保留抗性，tet(33)因IS6100相关缺失而丢失，而sul1等非靶标ARGs常被保留。16周时，sul1和qacEΔ1的残留DNA占比达71.3-81.7%，显著高于tet(33)和cmx（<3.5%）。
抗生素降解菌中ARGs携带的普遍性：对26株四环素降解菌基因组分析显示，ARGs携带普遍，平均含15个ARGs（中位数10）和31个MGEs（中位数16），除四环素相关ARGs外，多数菌株还携带非靶标ARGs，13株检测到质粒携带的ARGs，表明OTC-16的风险并非个例。
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