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Plant Commun | 华中农业大学吴昌银团队揭示调控水稻穗腋生分生组织形成分子机制

2026-06-09 17:27:27

水稻是全球近一半人口的主粮，其产量在很大程度上由株型性状决定，包括分蘖数、穗分枝数和穗粒数。腋生分生组织的形成是塑造这些株型结构的细胞基础，它既产生营养期的分蘖，也在生殖发育期形成花序分枝和小穗，最终构成稻穗。过去几十年，遗传学研究已经鉴定出多个调控腋生分生组织形成和花序发育的核心因子，如MOC1/SPA、LAX1、LAX2以及MADS-box和SBP-box家族成员。然而，这些调控因子之间的层级关系和精确的分子互作网络仍不清楚。特别令人困惑的是，LAX1编码一个bHLH转录因子，但其碱性区域仅含有4个碱性氨基酸，远低于典型bHLH蛋白通常所需的5个以上，因此长期以来被认为缺乏内在的DNA结合能力，只能通过与其他DNA结合伙伴二聚化来间接调控转录。这一认知空白严重阻碍了人们对LAX1分子机制的理解，也限制了对这一重要产量基因的育种应用。

2026年5月25日，华中农业大学生命科学技术学院吴昌银教授团队在《Plant Communications》在线发表（非最终校稿）了题为“LAX PANICLE1 acts as a canonical bHLH transcription factor to regulate inflorescence axillary meristem formation in rice”的研究论文，研究通过系统进化配体指数富集技术联合染色质免疫沉淀测序，发现LAX1不仅定位于细胞核、具有转录激活活性，而且具备内在的DNA结合能力。进一步鉴定出LAX1直接识别的一个全新顺式元件TTTTGC(T/A/C)NNN(G/A/T)，并证实LAX1通过直接结合OsPID、OsIAA7、LOG等关键基因的启动子来激活其转录。这一调控机制在玉米和小麦中高度保守。研究将LAX1重新定义为经典bHLH转录因子，为通过操控其直系同源基因改良谷物产量提供了理论依据。

研究团队首先验证了LAX1是否具备经典转录因子的核心功能域。通过SMART数据库预测到一个位于第28-39位氨基酸的核定位信号，GFP-LAX1融合蛋白在原生质体中与核标记API5共定位，而缺失该信号的突变体则在整个细胞中弥散分布。转录激活域定位实验显示，C端区域（第90-215位氨基酸）在水稻原生质体和酵母中均表现出强烈的转录激活活性。酵母双杂交和体外pull-down实验进一步证实，包含bHLH结构域的区域（第31-99位氨基酸）能够介导LAX1形成同源二聚体。令人意外的是，电泳迁移率实验显示LAX1并不能结合典型的E-box元件，但AlphaFold2结构预测提示其碱性区域暴露在蛋白表面，暗示可能识别非经典DNA序列。

图1 LAX1的核定位、转录激活和同源二聚体特征

为了直接检验LAX1是否具备DNA结合能力，研究人员采用SELEX技术，使用纯化的MBP-LAX1融合蛋白和含有25bp随机核心区的双链寡核苷酸文库进行体外筛选。经过七轮亲和选择和扩增后，对富集文库进行高通量测序，获得60条高亲和力序列（其中49条唯一序列）。MEME基序分析揭示了一个保守的11bp简并基序TTTG(C/T/G)NNN(T/G/C)(T/A/G)，其中序列TTTTGCTCCTA的显著性最高。EMSA证实MBP-LAX1蛋白能够特异性结合该探针，且未标记竞争探针可剂量依赖性地减弱结合信号。在水稻原生质体中，包含该基序的LUC报告基因在LAX1共表达时被显著激活，进一步证实LAX1既能直接结合该基序，又能激活下游转录。

图2 SELEX鉴定LAX1高亲和力DNA结合基序

为研究LAX1在体内的DNA结合特性，研究团队构建了pLAX1::mCherry:LAX1互补载体并转化lax1突变体。在30株独立T0转化体中，24株为阳性，其中# 4株系完全恢复了野生型水平的一级分枝数和侧生小穗形成。免疫印迹分析在幼穗中检测到约51kDa的融合蛋白条带，共聚焦显微镜显示mCherry荧光信号在花序分生组织边界和腋生分生组织中的时空表达模式与内源LAX1完全一致，表明该融合蛋白保留了LAX1的天然功能。

随后，研究人员利用该互补株系的幼穗进行ChIP-seq分析，两个生物学重复共鉴定到13,330个共同结合峰，对应13,092个基因，Pearson相关系数达0.99。基因组注释显示96.94%的结合峰位于转录起始位点上游3kb启动子区域内，说明LAX1主要通过结合启动子区调控转录。HOMER基序分析鉴定了5个显著富集的基序，其中基序4（TT[C/T]GCCTTAA）与SELEX得到的基序相似度最高，代表了一个此前未与已知转录因子关联的新序列。值得注意的是，有32个已鉴定的穗发育关键调控因子被鉴定为LAX1靶基因，包括转录因子（OsSPL13、OsMADS37等）、激素通路组分（OsPID、OsIAA7、LOG等）和淀粉糖代谢基因（OsTPS8等）。ChIP-qPCR验证了LAX1在含有这5类基序的代表性基因启动子区域的显著富集。

图3 ChIP-seq全基因组鉴定LAX1结合基序与靶基因

为了进一步精确定义LAX1直接结合的DNA序列，研究人员利用SELEX得到的基序为查询序列，在12,795个靶基因的启动子区进行扫描，鉴定出5,308个基因的启动子含有该基序。在此基础上进行denovo基序分析，得到11 bp简并基序TTTTGC(T/A/C) NNN(G/A/T)，该基序与基序4显著重叠，被定义为LAX1在体内的核心结合元件。OsIAA7、LOG和OsTPS8的启动子均含有该序列，ChIP-seq谱图显示这些基因启动子区有明显富集。EMSA证实LAX1蛋白能够直接结合来自这三个基因启动子的生物素标记探针，且结合可被未标记探针竞争。LUC报告实验显示LAX1能显著激活这三个基因的启动子驱动的报告基因表达，而bHLH结构域缺失突变体则不能。qRT-PCR进一步确认，在lax1突变体幼穗中，OsIAA7、LOG和OsTPS8的表达量均显著下调。

图4 LAX1直接结合并激活OsIAA7、LOG和OsTPS8表达

为系统解析LAX1的生物学功能，研究团队对野生型和lax1突变体幼穗进行了比较转录组分析。主成分分析显示三个生物学重复紧密聚类，共鉴定出2,100个显著差异表达基因，其中下调基因930个、上调基因1,170个。KEGG富集分析显示，下调基因显著富集于植物激素信号转导以及淀粉和蔗糖代谢途径。在这些下调基因中，鉴定出22个激素信号转导相关基因和8个淀粉蔗糖代谢相关基因，包括已知的穗发育调控因子OsPID、OsIAA7和LOG。qRT-PCR验证了这些基因在lax1中的下调趋势，激素含量测定显示lax1幼穗中IAA和活性细胞分裂素（iP和反式玉米素）显著降低，而淀粉和蔗糖含量则显著升高。将ChIP-seq鉴定的12,795个LAX1靶基因与穗部性状QTL区间整合分析发现，2,977个基因与一级枝梗数相关，2,127个与小穗数相关，1,726个与二者均相关，这些基因的GO富集分析同样指向植物激素信号传导、碳代谢和氨基酸生物合成。

图5 lax1突变体幼穗转录组分析揭示多条下游通路

鉴于OsPID在转录组中显著下调，且其启动子区-405至-395 bp位置含有一个LAX1结合基序TTTTGCTCCTA，研究团队进一步验证了LAX1对OsPID的直接调控。ChIP-PCR和EMSA均证实LAX1直接结合该基序，且瞬时表达实验显示LAX1能显著激活OsPID启动子驱动的报告基因。为研究OsPID的生物学功能，利用CRISPR/Cas9技术构建了Ospid突变体（Ospid# 6），该突变体在激酶结构域发生H85S和I95V氨基酸改变。尽管Ospid# 6在株高和分蘖数上无明显缺陷，但其穗部表型极为稀疏，一级枝梗数和一级枝梗小穗数减少约40%，二级枝梗数和二级枝梗小穗数减少超过50%，表型类似lax1。扫描电镜观察显示，lax1和Ospid# 6在一级枝梗原基形成阶段的原基数均显著减少。原位杂交显示，OsPID在野生型花序分生组织和腋生分生组织中特异性表达，而在lax1突变体中，OsPID在腋生分生组织起始位点的表达几乎消失。然而，在lax1背景下过表达OsPID并不能恢复稀疏穗表型，表明LAX1通过协调激活多条下游通路来维持完整的分生组织功能。

图6 LAX1-OsPID模块调控腋生分生组织形成

最后，研究团队探索了LAX1调控网络的进化保守性。LAX1在玉米中的直系同源物BA1和在小麦中的直系同源物TaLAX1，其bHLH结构域完全保守，碱性区域同样仅含4个碱性残基。基于水稻中鉴定的12,795个LAX1靶基因，在玉米和小麦基因组中分别鉴定出9,486和24,901个直系同源基因，其中5,722个核心基因在三个物种中共有。KEGG富集分析显示，这些共享靶基因在三个物种中均显著富集于植物激素信号转导、氨基酸生物合成、RNA剪接等通路。LAX1直接结合基序存在于63.60%的玉米候选靶基因和64.71%的小麦候选靶基因启动子中。OsPID的直系同源基因（玉米BIF2和小麦TaPID）启动子区均含有与水稻OsPID启动子中LAX1结合基序高度相似的序列，EMSA证实BA1和TaLAX1蛋白能直接结合各自启动子探针。

图7 LAX1调控网络在玉米和小麦中的进化保守性

研发现LAX1不仅定位于细胞核、具有转录激活活性，而且具备内在的DNA结合能力。鉴定出LAX1直接识别的一个全新顺式元件TTTTGC(T/A/C)NNN(G/A/T)，并证实LAX1通过直接结合OsPID、OsIAA7、LOG等关键基因的启动子来激活其转录。这一调控机制在玉米和小麦中高度保守。研究将LAX1重新定义为经典bHLH转录因子，为通过操控其直系同源基因改良谷物产量提供了理论依据。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.molp.2026.02.015

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