近日，沈阳农业大学草莓研究团队在国际知名期刊《Plant Biotechnology Journal》上在线发表题为 “A novel function for the transcription factor sensitive to proton rhizotoxicity1 in promoting anthocyanin accumulation in strawberry” 的研究论文。该研究首次揭示植物环境胁迫适应关键因子STOP1在草莓果实中通过双重途径正向调控花青苷积累，即：（1）正向调控花青苷转运基因FvTT19的表达；（2）干扰花青苷抑制复合物FvMYB1-FvbHLH33的形成。该研究不仅拓展了STOP1蛋白在植物次生代谢中的功能，更阐明了转录因子通过“激活-去抑制”双路径调控花青苷合成的新机制，为通过分子育种提升草莓果实品质提供了重要理论依据。果实颜色是草莓重要的农艺性状之一，其呈色多样性主要由花青苷积累水平的差异决定。尽管C2H2型锌指转录因子STOP1已被证实参与植物抗铝胁迫、根系发育及非生物胁迫响应等过程，但其在花青苷代谢调控中的功能尚未明确。该研究揭示了草莓FvSTOP1在调控花青苷积累中的功能及其作用机制，主要研究结果如下：1. FvSTOP1正向调控花青苷积累
为挖掘调控草莓花青苷积累的新因子，该研究以花青苷负调控因子MYB1为诱饵，通过酵母双杂交文库筛选获得与其互作的蛋白FvSTOP1。为解析其调控功能，分别构建了FvSTOP1过表达株系和CRISPR/Cas9基因编辑株系，表明FvSTOP1过表达植株果实花青苷含量显著增加，同时花青苷生物合成通路关键基因（FvCHS、FvF3H、FvDFR、FvANS）及转运基因（FvTT12、FvTT19）的表达显著上调（图1a-1c）。FvSTOP1基因编辑植株呈现相反表型，花青苷积累量降低，且上述基因表达显著下调（图1d-1f）。
图1草莓FvSTOP1稳定过表达和敲除植株果实中花青苷的积累
2. FvSTOP1直接结合FvTT19启动子，促进花青苷积累
为揭示FvSTOP1促进花青苷积累的机理，研究者采用酵母单杂交技术鉴定FvSTOP1潜在调控的花青苷合成代谢基因。结果显示，FvSTOP1特异性结合转运基因FvTT19启动子区（-534至-1 bp）（图2a），但未检测到其与生物合成基因（FvCHS、FvF3H等）启动子的直接互作。此外，LUC试验和GUS试验均证明FvSTOP1直接调控FvTT19的表达（图2b-e）。随后，研究者在FvSTOP1过表达植株中干扰FvTT19，发现草莓果实颜色变浅（图2f-h）。这表明FvSTOP1通过直接结合FvTT19启动子，从而促进花青苷积累。
图2 FvSTOP1结合FvTT19启动子促进花青苷积累
3. FvSTOP1破坏FvMYB1-FvbHLH33复合体的形成
为了进一步揭示FvSTOP1促进草莓花青苷积累的机理，研究者对FvSTOP1和花青苷负调控因子FvMYB1的互作关系进行验证，发现FvSTOP1能与FvMYB1互作，且与FvbHLH33也具有相互作用（图3a）。那FvSTOP1-FvMYB1-FvbHLH33复合物如何调控花青苷的积累？研究者首先对FvSTOP1、FvMYB1和FvbHLH33蛋白互作区域进行鉴定，结果表明，FvMYB1的N端bHLH结构域（1-114 aa）与FvbHLH33的N1区域（1-197 aa）（图3c）及FvSTOP1的C端区域（414-523 aa）存在相互作用（图3d），此外，FvbHLH33的N1结构域（1-197 aa）还与FvSTOP1的C2H2锌指结构域（253-413 aa）特异性结合（图3e）。
接下来，研究者进一步采用酵母三杂交和pull-down实验证明了FvSTOP1阻碍了FvMYB1和FvbHLH33的相互作用，干扰了花青苷抑制复合物FvMYB1-FvbHLH33的形成（图3f-g）。 图3FvSTOP1阻碍花青苷抑制复合物FvMYB1-FvbHLH33的形成
4. FvSTOP1干扰FvMYB1-FvbHLH33抑制复合物形成，促进花青苷相关基因的表达
为了进一步探究 FvSTOP1 是否通过干扰 FvMYB1-FvbHLH33 抑制复合物的形成来影响草莓花青苷相关基因的表达及花青苷积累，研究者在野生型森林草莓（RG）和 FvSTOP1 基因敲除突变体（fvstop1-cr2#）的果实中进行了瞬时表达分析。结果表明：在 fvstop1-cr2#突变体果实中共注射 FvMYB1-RNAi 和FvbHLH33-RNAi（fvstop1-cr2#/FvMYB1-RNAi+FvbHLH33-RNAi），相较于在野生型（RG）果实中进行相同处理（RG/FvMYB1-RNAi+FvbHLH33-RNAi），其果实颜色变为淡红色，且花青苷相关基因的表达水平显著下调（图 4a, b）。这一结果表明，FvSTOP1 可能通过干扰 FvMYB1-FvbHLH33 抑制复合物的形成，促进了花青苷相关基因的表达。
为深入研究 FvSTOP1-FvMYB1-FvbHLH33 三元复合物如何调控花青苷积累关键基因的表达，研究者将 FvTT19、FvCHS 和 FvF3H 的启动子分别连接至 LUC 和 GUS 报告基因上，并在烟草叶片和草莓果实中进行瞬时表达分析。LUC 和 GUS 活性检测结果表明：当 FvMYB1 和 FvbHLH33 与 FvTT19 启动子报告基因共注射时，FvTT19 的启动子活性低于单独注射 FvMYB1 时的水平；然而，当 FvSTOP1、FvMYB1 和 FvbHLH33 三者共注射时，FvTT19 的启动子活性则被显著激活（图 4c, d）。FvCHS 和 FvF3H 启动子报告基因也得到了相似的结果（图 4e-h）。这些结果表明，FvSTOP1 能够拮抗由 FvMYB1 和 FvbHLH33 形成的抑制性复合物，从而解除该复合物对草莓果实花青苷相关基因（如 FvTT19、FvCHS、FvF3H）的转录抑制，最终促进了花青苷的积累。图4FvSTOP1通过干扰FvMYB1-FvbHLH33抑制复合物的形成促进花青苷积累
综上所述，本研究系统解析了草莓FvSTOP1转录因子调控花青苷积累的分子机制（图5），首次揭示STOP1蛋白在花青苷代谢中的调控功能，对改善草莓的色泽品质奠定了重要基础。图5 FvSTOP1促进草莓果实花青苷积累的模式图
沈阳农业大学园艺学院博士研究生边瑞青为该论文的第一作者，张俊祥副教授和张志宏教授为该论文的共同通讯作者，博士研究生姚晋湘，硕士研究生聂宇欣、张钰莹、吴正佳也参与了该研究工作。该研究得到了国家自然科学基金等项目的资助。论文链接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.70194
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