PBJ | 安徽农业大学武健东、李晓玉课题组揭示O11-ZmSSRP1模块调控玉米籽粒淀粉合成机制

1、ZmSSRP1是水稻OsFLO6 在玉米中的同源基因、 在胚乳发育过程中高度表达

研究者课题组前期报道了玉米 ZmSSRP1 和 ZmCBM48-1 这两个含有 CBM48 结构域的非酶蛋白的过表达能够增加水稻的淀粉合成(Peng et al., 2022; Chen et al., 2022)。然而，玉米中含CBM48 结构域的蛋白质参与胚乳淀粉合成的情况仍有待阐明。研究者通过序列比对、进化树分析、亚细胞定位和表达分析发现ZmSSRP1是一个与水稻中OsFLO6高度同源的、在质体定位的、玉米籽粒胚乳高度表达的、具有碳绑定结构域CBM48（carbohydrate-binding module 48）的非酶蛋白质（图1）。

2、ZmSSRP1 调控玉米的籽粒大小和产量

为分析ZmSSRP1在玉米中的功能，研究者通过CRISPR/Cas9技术创制了ZmSSRP1的突变体材料zmssrp1-1和zmssrp1-2。同时，也构建了ZmSSRP1的过量表达材料ZmSSRP1-OE#1和ZmSSRP1-OE#2。表型分析发现zmssrp1 突变体的籽粒变小。野生型KN5585、zmssrp1突变体和ZmSSRP1-OE株系的籽粒长度和宽度相似，与野生型 KN5585相比，zmssrp1突变体的籽粒厚度和百粒重减少，而ZmSSRP1-OE株系的籽粒厚度和百粒重增加（图2）。这些结果表明ZmSSRP1可能正调控玉米的籽粒大小和产量。

3、ZmSSRP1调控淀粉合成相关基因的表达

对野生型和zmssrp1突变体籽粒进行转录组分析发现，与野生型相比，在授粉后21天的突变体籽粒中，共检测到4300个差异表达基因，其中 45.5%（1,956/4,300）下调，54.5%（2,344/4,300）上调（FC>1.5, FDR< 0.05）。对差异基因进行（GO）富集分析表明，下调基因被显著归入脂质储存、碳水化合物衍生物分解过程、6-磷酸葡萄糖代谢过程、单器官碳水化合物分解过程、碳水化合物转运和碳水化合物分解过程等类别；上调基因则明显富集在葡萄糖稳态、细胞葡萄糖稳态、碳水化合物稳态、葡萄糖醛酸聚氧乙烯醚生物合成过程、葡萄糖 6-磷酸代谢过程中。在zmssrp1-1突变体中发现了一系列参与淀粉合成的代表性基因，如ZmUPG2.3、ZmAGPS2、ZmGpm334、ZmSus1、ZmMdh4、ZmPHO2、ZmABI19和ZmGBSS1等，并对其进行了RT-qPCR的验证分析。这些结果表明，ZmSSRP1可能参与了玉米胚乳淀粉合成（图3）。

4、ZmSSRP1 调控玉米胚乳淀粉生物合成

前面这些结果暗示ZmSSRP1可能参与淀粉合成，因此研究者进行了更加细致的分析。籽粒切片观察发现,与KN5585相比，zmssrp1突变体的籽粒外观不透明且含淀粉，胚和胚乳较小。相反，ZmSSRP1-OE籽粒胚和胚乳较大。显微镜观察发现，野生型KN5585、zmssrp1-1突变体和ZmSSRP1-OE#1株系在形态上存在差异。与野生型 KN5585 相比，zmssrp1-1 突变体的胚和胚乳较小，胚乳细胞尺寸减小，而ZmSSRP1-OE#1则出现了相反的表型。通过扫描和透射电子显微镜观察发现，与野生型KN5585籽粒相比，zmssrp1 突变体胚乳中的淀粉颗粒明显较小。相反，ZmSSRP1-OE表现出更大的淀粉颗粒。此外，zmssrp1突变体的总淀粉、直链淀粉和支链淀粉含量降低，而粗蛋白、可溶性糖和还原糖含量增加。有趣的是，与野生型KN5585 相比，ZmSSRP1-OE中除直链淀粉含量外的大多数成分基本保持不变。这些结果表明ZmSSRP1调控玉米胚乳淀粉合成。

5、O11 与 ZmSSRP1 启动子结合并激活其表达

为进一步确定 ZmSSRP1 在玉米胚乳淀粉合成过程中的分子机制，研究者分析了ZmSSRP1核心启动子区域，并在其核心启动子区域发现了两个核心motif序列，即E-box motif。已有研究表明E-box motif能与bHLH转录因子结合和，既可作为转录激活因子，也可作为抑制因子(Toledo-Ortiz et al., 2003)。在玉米中，O11编码一种胚乳特异性bHLH转录因子，它通过减少胚乳大小和淀粉含量来影响籽粒发育(Feng et al., 2018; Grimault et al., 2015)。因此，研究者验证了ZmSSRP1是否是O11的直接靶标，通过多种方法证明了O11 与 ZmSSRP1 启动子结合并激活ZmSSRP1的表达。

6、O11 与 ZmSSRP1 遗传互作调控玉米胚乳中支链淀粉和直链淀粉依赖的淀粉生物合成

研究者对o11和O11-OE材料进行了细致表型分析，进一步证实O11正向调控玉米籽粒淀粉含量，与之前研究报道一致(Feng et al., 2018)。为分析O11和ZmSSRP1的遗传关系，研究者通过遗传杂交创制了o11 × zmssrp1-1双突变体材料。表型分析显示。在扫描电镜下，与o11和zmssrp1-1单突变体相似，纯合双突变体的淀粉粒径减小。同样地，双突变体的淀粉、直链淀粉和支链淀粉含量低于单突变体，而双突变体的粗蛋白和还原糖含量高于 o11 突变体。这些结果表明在玉米胚乳内淀粉合成的调控途径中，ZmSSRP1在O11的下游或与O11并行发挥作用。

7、ZmSSRP1不与玉米淀粉合成关键酶ZmGBSS1、ZmISA1和ZmSS4互作

研究者也进一步探究ZmSSRP1调控籽粒淀粉合成的分子机理。在拟南芥和水稻中，ZmSSRP1同源蛋白通过与不同的淀粉生物合成酶相互作用来影响淀粉含量。在拟南芥叶片中，AtPTST1直接与GBSS相互作用，并介导其靶向淀粉颗粒以调节淀粉含量(Seung et al., 2015)。在水稻中，水稻PTST1的同源蛋白OsGBP与水稻胚乳中的OsGBSSI和 OsGBSSII结合并介导它们进入淀粉颗粒(Wang et al., 2019)。在拟南芥叶片中，AtPTST2 与SS4、MFP1 和MRC相互作用，但不与GBSS 和 ISA 相互作用(Seung et al., 2017; Seung et al., 2018; Vandromme et al., 2019)。在水稻中，FLO6 与 OsLESV 和 OsISA1 相互作用，并促进 ISA1 在淀粉粒上定位(Peng et al., 2014; Yan et al., 2024)。OsLESV 与 GBSSI、GBSSII 和 PPDKB 相互作用，以维持其蛋白质稳定性和酶活性，并促进 GBSSI 和 GBSSII 与淀粉颗粒结合(Dong et al., 2024)。因此，研究者也通过荧光素酶互补成像（LCI）和双分子荧光互补（BiFC）验证了ZmSSRP1与ZmGBSS1、ZmISA1 和 ZmSS4的互作情况，结果显示与其水稻中同源蛋白FLO6不同，ZmSSRP1并不与淀粉合成关键酶如可溶性淀粉合成酶(ZmSS4)和淀粉脱分支酶(ZmISA1)相互作用，暗示ZmSSRP1在玉米中的功能分化，形成不同的籽粒胚乳淀粉合成分子机制。在将来的研究中，利用多种技术（如共免疫沉淀、酵母双杂交、接近标记和酵母单杂交）检测O11-ZmSSRP1模块相互作用蛋白、上游调控因子，将为O11-ZmSSRP1影响玉米淀粉生物合成的机制提供更多信息。

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