湖南农业大学罗洁教授等:酶解处理对果胶-凝乳酶酪蛋白乳液特性的影响

李沛岭¹，王淼琳¹，王彩云²，梁超²，许颖³，周磊¹，罗洁^1*

（1.湖南农业大学食品科学技术学院，长沙 410128；2.国家乳业技术创新中心有限公司，呼和浩特 010100；3.伊利伊诺科技(上海)有限责任公司，上海 201100）

摘　要：凝乳酶酪蛋白是副κ-酪蛋白在钙桥等作用力下，形成的难溶解钙-副酪蛋白磷酸复合物，其乳液稳定性较低。文章通过果胶-酶解协同作用，提高凝乳酶酪蛋白乳液稳定性。通过研究胰蛋白酶处理时间（0、10、20、30、40 min）及3种类型果胶（0.4%高甲氧基果胶、0.4%低甲氧基果胶及0.2%高甲氧基果胶和0.2%低甲氧基果胶复配）协同对凝乳酶酪蛋白乳液的乳化特性、乳液稳定性、粒径分布、Zeta电位和乳液稳定性的影响，探究多糖和酶解处理对凝乳酶酪蛋白乳液性能的影响。结果表明，随着酶解处理时间增加，高甲氧基果胶-凝乳酶酪蛋白乳液、低甲氧基果胶-凝乳酶酪蛋白乳液和复配果胶-凝乳酶酪蛋白乳液的底层不溶性凝乳酶酪蛋白沉淀逐渐减少，且复配果胶-凝乳酶酪蛋白乳液的乳化层逐渐增厚，高甲氧基果胶-凝乳酶酪蛋白乳液的乳化活性指数显著升高。随着酶解时间增加，复配果胶凝乳酶酪蛋白乳液的不稳定指数逐渐下降、乳滴粒径逐渐降低，而Zeta电位绝对值先下降而后在30 min酶解后无显著性变化。不同pH值下3组果胶-凝乳酶酪蛋白乳液对比显示，pH=6.0时复配果胶组（低甲氧基果胶∶高甲氧基果胶=1∶1，0.2%）酶解处理40 min的整体乳化特性最佳。文章为凝乳酶酪蛋白乳化特性改善提供了新方法。

关键词：凝乳酶酪蛋白；胰蛋白酶；果胶；乳化特性

中图分类号：TS252.1

文献标识码：A

DOI:10.19827/j.issn1001-2230.2026.03.005

0　引　言

再制干酪加工过程中需加入柠檬酸盐、磷酸盐等乳化盐以螯合天然干酪中不溶性凝乳酶酪蛋白含有的钙离子，并形成均一的乳化体系^[1-2]。但乳化盐的加入会使再制干酪中钠含量显著增加，可达1 500 mg/100 g。研究表明，摄入过高的钠可能会引发心脏病、高血压、中风等疾病风险^[3]。目前再制干酪中常用降低钠含量的方法主要包括：（1）减少含钠乳化盐添加量；（2）用非钠盐替代；（3）利用功能性物质（如蛋白质、多糖）替代乳化盐^[4-6]。但不同的降低乳化盐方法在减钠脱钙同时也会对再制干酪风味、质地、功能特性等产生负面影响^[7]。

凝乳酶酪蛋白是天然干酪中主要的蛋白质，也是再制干酪中的基础蛋白质。低盐条件下，不溶性凝乳酶酪蛋白溶解性下降，使其难以发挥乳化作用，形成均一的干酪质构。因此，如何提升凝乳酶酪蛋白的乳化特性对减盐再制干酪品质改善和稳定性提升至关重要^[1-2,7]。近年来，酶解处理和多糖结合改性成为改良蛋白质功能特性的研究热点。蛋白酶改性是利用蛋白酶在温和条件下水解蛋白质，改变蛋白质结构，从而使蛋白质获得更好的稳定性和功能性。胰蛋白酶是由胰腺分泌的消化酶之一，其主要作用于小肠内，将蛋白质和多肽分解为大小不等的肽段，对蛋白质水解起着重要作用^[8-10]。前期研究表明，胰蛋白酶酶解凝乳酶酪蛋白可产生纳米多肽颗粒，颗粒吸附于脂滴表面，减少脂肪液滴聚集，一定程度提升乳液乳化活性，但改善效果有限^[11-13]。

果胶是从植物组织中提取的天然生物大分子多糖，根据酯化度不同，主要分为高甲氧基果胶（酯化度>50%）和低甲氧基果胶（酯化度<50%）。果胶分子中含有疏水基团和亲水基团，两亲性果胶溶于水后会发生自主装，聚集形成胶束（果胶的聚集体）^[14-15]。在钙离子存在的情况下，高甲氧基果胶胶束可吸附在乳液液滴表面，乳化作用得到改善，氯化钙复配的乳液与皮克林乳液相似^[16-18]。同时，果胶具有良好的亲水性和空间位阻效应，在与胶束酪蛋白结合后，可在油水界面形成稳定的膜结构，协同提升乳化特性^[19-20]。然而，目前关于复合果胶结合胰蛋白酶酶解处理对凝乳酶酪蛋白乳化特性的系统性研究未见报道。不同处理条件下，两者对凝乳酶酪蛋白结构与乳化性能的协同作用机制尚不明确。

本文通过研究胰蛋白酶处理时间及3组果胶添加对凝乳酶酪蛋白乳化特性的影响。通过分析其乳液乳化特性、乳液稳定性、粒径分布、Zeta电位和乳液稳定性的变化，探究多糖和酶解协同对凝乳酶酪蛋白乳液性能的影响，为减盐再制干酪的开发提供理论依据。

1　材料与方法

1.1　材料与试剂

凝乳酶酪蛋白，法国Eurial乳品集团；低甲氧基果胶（LM）、高甲氧基果胶（HM），阿泽雷斯国际贸易有限公司；胰蛋白酶（250 U/mg），上海源叶有限公司；玉米油，益海嘉里金龙鱼食品集团；氢氧化钾（分析纯）、柠檬酸（分析纯），国药集团化学试剂有限公司。

1.2　仪器与设备

纳米粒度分析仪，英国Worcestershire公司；激光衍射粒度分析仪，英国Malvern公司；多重光散射仪，法国Formulaction公司；高速剪切仪，德国IKA公司。

1.3　试验方法

1.3.1　乳液制备

将30 g凝乳酶酪蛋白和4 g果胶溶解于1 L模拟乳超滤液中，用1 mol/L KOH溶液调节pH为8.1。室温搅拌过夜后，利用胰蛋白酶在37 ℃酶解不同时间（0、10、20、30、40min）并取样。样品经80 ℃灭活30 min，调节pH于选定范围后，取28.5 mL酶解液于血清瓶中，依照5%油相比例添加玉米油，混合物在22 500 r/min条件下高速剪切2 min，获得凝乳酶酪蛋白-果胶复合乳液。

1.3.2　Zeta电位

蛋白-多糖复合溶液的Zeta电位测定采用纳米粒度分析仪。蛋白-多糖复合溶液在测试前用去离子水稀释100倍，测量条件保持在25 s，平衡时间为2 min。

1.3.3　粒径分布

使用Mastersizer 3 000激光衍射粒度分析仪在25 ℃下测量乳剂的液滴大小。水折射率为1.333，脂肪球在466 nm处折射率为1.460，平衡时间为20 s，最终的乳液粒径使用体积加权平均值和平均直径表示。

1.3.4　微观结构

使用装有数码相机Nikon E100的显微镜在40倍下拍摄乳液显微照片，从中部吸取乳液，于载玻片上观察乳液液滴的形态和大小。

1.3.5　乳化活性及稳定性分析

乳化活性测定参考ZHOU等^[21]并加以修改。取28.5 mL蛋白-多糖复合物（或多糖）和1.5 mL玉米油于50 mL血清瓶中，利用IKA Ultra Turrax T25剪切仪在22 500 r/min高速剪切2 min获得乳液。于0 min吸取乳液，将其稀释于0.1%十二烷基硫酸钠溶液中，并测定在500 nm波长处吸光度。凝乳酶酪蛋白的乳化活性指数（Emulsifying activity index，EAI）按下列公式计算。

式中：EAI为在1 g蛋白质中乳化的面积，m²/g；C表示乳液的蛋白质浓度，g/mL；ρ是乳液的油体积分数（V/V），ρ= 5%；A0 为乳液在等待时间为0 min时于500 nm波长处的吸光度。

1.3.6　乳液稳定性分析

使用稳定性分析仪（TSI）测定乳液不稳定性。取30 mL乳液于血清瓶中，用脉冲近红外（800 nm）光源在25 ℃下扫描6 h。获得乳液透射光、背散射光和乳液不稳定性指数（TSI）。

1.4　数据处理

所有试验均重复3次，所得数据采用平均值±标准差表示。数据通过Excel 2021处理，并使用统计软件SPSS 26.0对数据进行分析和显著性分析（P＜0.05），使用Origin 2021软件绘图。

2　结果与分析

2.1　不同果胶乳液的乳化特性

由图1（a）可见，对不同果胶的乳化特性进行了测定，低甲氧基果胶乳化活性最高，复配果胶的乳化活性居中，而高甲氧基果胶的乳化活性最低。可能是高甲氧基果胶中的两亲分子在水溶液中自组装形成的胶束颗粒大小不均匀，从而降低其乳化活性^[18]。由图1（b）可见，3类果胶乳化稳定性结果较好，在室温下静置30 min后无明显分层及油脂析出。

图1　不同果胶乳液的乳化活性和乳液稳定性

2.2　酶解处理对不同pH条件下凝乳酶酪蛋白-果胶乳液乳化特性的影响

pH会影响酪蛋白结构、大小和组成，导致其理化性质改变^[22]。3组果胶-凝乳酶酪蛋白乳液随胰蛋白酶处理时间增加，静置30 min后其底层不溶性凝乳酶酪蛋白沉淀逐渐减少。高甲氧基果胶组乳液的乳化活性在30 min时最高，而后随酶解时间增加逐渐降低，见图2，随着凝乳酶酪蛋白水解引起游离钙含量增加，与此同时高甲氧基果胶自组装形成的颗粒和水解产生的多肽协同作用，大幅提升了起泡性。而在剪切阶段产生大量泡沫，影响乳化活性测定结果。

图2　酶解处理对不同pH条件下高甲氧基果胶-凝乳酶酪蛋白乳化活性及乳液稳定性的影响

低甲氧基果胶组在酶解20~40 min内乳化活性随着pH增加而升高，在酸性条件下越趋近于酪蛋白等电点时，乳化活性随pH降低而降低。低甲氧基果胶组整体稳定性较差，见图3，可能是酶解凝乳酶酪蛋白产生过量游离钙离子诱导低甲氧基果胶凝胶，从而降低乳液稳定性。研究表明果胶凝胶会降低乳液稳定性^[23-24]。

图3　酶解处理对不同pH条件下低甲氧基果胶-凝乳酶酪蛋白乳化活性及乳液稳定性的影响

复配果胶乳液乳化层随酶解时间增厚，底部不溶性凝乳酶酪蛋白沉淀逐渐消失，见图4。复配果胶（0.2%:0.2%）结合胰蛋白酶酶解40 min时，整体乳化特性最佳。可能由于果胶和酶解后多肽结合增加了吸附层厚度，或果胶的加入增加了连续相黏度，从而提高了乳液稳定性^[25-27]。

图4　酶解处理对不同pH条件下复配果胶结合凝乳酶酪蛋白乳化活性及乳液稳定性的影响

2.3　乳液形态

为了阐明复合果胶协同胰蛋白酶处理对凝乳酶酪蛋白乳化特性影响，本试验固定凝乳酶酪蛋白添加浓度和果胶总添加量，探究不同酶解时间对复合乳液乳化特性的影响。乳液中脂肪球大小及分布对其稳定性有重要作用，越小的脂肪球粒径表明乳液稳定性越高^[27]。由图5可见，在未经酶解处理的样品组，由于脂肪球聚并且乳液失稳，脂肪球粒径大小分布不均。不同酶解时间下乳液中脂肪球的微观结构，随胰蛋白酶酶解时间增加，乳液粒径逐渐降低。经过胰蛋白酶处理30 min和40 min后的乳液液滴分散均匀，果胶和多肽层逐渐吸附于油滴表面，依附层逐渐加厚^[28]。

图5　酶解处理对pH=6.0条件下复配果胶结合凝乳酶酪蛋白乳液的微观结构的影响

2.4　乳液粒径及电位

由图6（a）可见，未经过酶解处理的果胶-蛋白乳液粒径主要呈现双峰分布，主峰分布于10.00~100.00 μm，次峰分布于100.00~1 000.00 μm范围内，乳液为多分散形乳液。结果表明，未经酶解处理的乳液，脂肪球粒径分布不均导致乳液稳定性下降。随着酶解时间增加，乳液中脂肪球粒径逐渐减小，当酶解20 min后粒径降低至10.00~100.00 μm范围内，位于100.00~1 000.00 μm的次峰消失。酶解30 min后对峰值分布区间影响较小，但对峰型有一定影响，峰型分布更细更高，表明脂肪球粒径分布在10.00~100.00 μm范围内愈加集中，大小均匀。继续酶解至40 min时，峰高降低，整体左移，表明经过40 min酶解后，脂肪球粒径持续减小。结果表明，酶解处理可显著降低乳液粒径，乳液分布更加均匀。经过不同酶解时间乳液的电位变化见图6（b），随着酶解时间增加，乳液的电位呈先降后升趋势。电位绝对值越高，乳液稳定性越强^[19]。结果表明，酶解可改变蛋白质的结构和乳液界面组成，从而影响乳滴表面的电荷分布和静电斥力，导致乳液电位变化。

图6　不同酶解处理时间对pH=6.0条件下复配果胶结合凝乳酶酪蛋白乳液粒径分布及电位的影响

2.5　乳液不稳定性

顶部背散射光强度越高，表明可能存在脂肪上浮。底部背散射光的光强越高，表明沉淀量越少。较高的TSI值表明乳液稳定性较低，由图7可见，随酶解时间增加，底部沉淀速度逐渐减缓，沉淀量逐渐减少。未经酶解处理的样品，不溶性凝乳酶酪蛋白在短时间内快速沉淀于底部，未完全酶解的不溶性蛋白在6 h内缓慢沉淀。随着酶解时间增加，乳液整体开始分层的时间逐渐推迟，整体稳定性增加，经酶解40 min后乳液稳定性最佳。

图7　pH=6.0条件下复配果胶结合酶解处理凝乳酶酪蛋白乳液的背散射光参比

酶解处理凝乳酶酪蛋白乳液的动力学不稳定性数据见图8，TSI值越高表明乳液稳定性较低。由于经酶解处理，蛋白起泡性增加引起顶部泡沫层较高，所以主要参考乳液的中部、底部和整体结果。结果表明，酶解处理时间0 min的样品TSI值在中部、底部和整体均最高，最低是经40 min酶解处理后的样品。表明酶解处理0 min的样品稳定性最差，酶解处理40 min的样品稳定性最好。经酶解处理40 min后的样品，稳定性显著高于其他组样品。可能由于果胶和酶解后多肽的结合增加了吸附层的厚度，在油水界面形成了保护层，提供更多的静电或空间排斥力，或因果胶增加了连续相的黏度，从而提高乳液稳定性。

图8　pH=6.0条件下复配果胶结合酶解处理凝乳酶酪蛋白乳液的动力学不稳定性

3　讨　论

本试验通过添加不同甲氧基化程度的果胶并结合胰蛋白酶酶解处理，探究其对凝乳酶酪蛋白乳液乳化特性的影响。结果表明，果胶类型、酶解时间及pH对乳液的乳化活性和稳定性具有显著影响，且酶解处理与果胶的协同作用可显著改善乳液的乳化特性。低甲氧基果胶表现出最高的乳化活性，而高甲氧基果胶的乳化活性最低。这一差异可能与果胶分子结构及其在水溶液中的自组装行为有关^[16]。高甲氧基果胶因疏水性较强，易形成不均匀的胶束颗粒，从而降低其乳化特性；而低甲氧基果胶因其较高的亲水性和电荷密度，能更有效地吸附于油-水界面，从而稳定乳液^[18]。复配果胶的乳化活性介于两者之间，结果表明，通过果胶比例可调节其乳化性能。胰蛋白酶酶解时间对果胶-蛋白复合乳液具有显著影响。随着酶解时间增加，凝乳酶酪蛋白的水解程度增加，底层不溶性沉淀逐渐减少，表明酶解增强了蛋白的溶解性和界面吸附能力。然而，高甲氧基果胶组在酶解30 min后乳化活性下降，可能与水解产生的游离钙离子及果胶-多肽相互作用导致的泡沫增多有关^[16]，干扰了乳化活性的准确测定。低甲氧基果胶组在酸性条件下乳化活性降低，可能是因为接近酪蛋白等电点而使蛋白质聚集沉淀导致。最终结果显示，复配果胶在酶解40 min时表现出最佳的乳化特性，表明适当的酶解能使果胶与多肽协同稳定乳液。脂肪球粒径分布和电位结果揭示了酶解改善稳定性的关键机制。未酶解乳液的粒径分布宽且不均匀（双峰分布），而酶解后粒径显著减小，且分布更集中，表明酶解通过减少脂肪球聚并提高了乳液的均匀性^[29]。此外，酶解40 min的乳液电位绝对值较高，表明界面电荷排斥力增强，进一步抑制了液滴聚集。背散射光强度和TSI值分析证实，酶解处理延缓了乳液分层和蛋白沉淀速率，尤其是40 min酶解组稳定性最佳。可能是果胶与酶解多肽在界面形成厚吸附层，同时连续相黏度的增加也可能贡献了空间位阻效应^[15,30]。本试验为改善凝乳酶酪蛋白乳液的稳定性提供了新策略，尤其是复配果胶与适度酶解的组合在食品工业（如乳制品、酱料）中具有应用前景。然而，高甲氧基果胶的起泡性可能限制其在高剪切产品（如再制干酪）中的使用，而低甲氧基果胶在钙离子存在时的凝胶化，则需通过配方优化（如添加螯合剂）等加以控制。

4　结　论

本文探索了胰蛋白酶酶解处理时间对果胶-凝乳酶酪蛋白复合物乳化特性的影响，并制备了乳化特性较好的复合果胶-凝乳酶酪蛋白乳液。结果表明，在pH =6.0远离酪蛋白等电点时，静电排斥力最大，乳液稳定性最佳。随着酶解时间延长，乳液粒径降低，分布更均匀；Zeta电位绝对值先降后升，表明酶解产生的多肽与果胶协同增强了界面静电斥力。复配果胶组结合酶解处理40 min，显著降低了乳液中脂肪球粒径，对乳液乳化活性及稳定性有显著提升，乳液不稳定性指数显著降低，其整体乳化特性最佳。果胶和酶解后多肽的结合增加了吸附层厚度，在油水界面形成了保护层，提供了更多的静电或空间排斥力，从而提高乳液稳定性，使得乳液具有良好的稳定性。为低盐凝乳酶酪蛋白的功能特性提升提供了新思路。

（参考文献略）

编辑：王剑飞

        马   艳

校对：王   鑫

审核：姜　爽