期刊： Microbial Cell Factories IF=4.9
原文链接：https://doi.org/10.1186/s12934-022-01976-1
背景：
棉籽粕（CSM）是棉籽油提取过程的主要副产品，蛋白质含量高，是饲料工业的重要蛋白质来源。然而，棉籽粕含有游离棉酚（FG），这是一种对动物健康有害的有毒物质，极大地限制了其应用。微生物发酵目前被认为是降低棉籽粕中FG及其他抗营养因子最有效的方法之一。先前，酵母和细菌种类已被用于降解棉籽粕中的FG，但其解毒效率较低。凝结魏茨曼氏菌兼具乳酸菌和芽孢杆菌的特性，可产生乳酸和芽孢，被认为是一种潜在的益生菌。本研究旨在评估并优化使用凝结魏茨曼氏菌进行固态发酵以去除棉籽粕中棉酚的效果。该文章研究了凝结魏茨曼氏菌通过棉籽粕发酵具有潜在的强降解游离棉酚能力。本研究提出了一种通过凝结魏茨曼氏菌S17进行固态发酵，以提高棉籽粕资源利用率和营养价值的可行工艺。
通讯作者：彭楠
主要单位：华中农业大学
该文章评估和优化利用凝结魏茨曼氏菌进行发酵的工艺，通过单因素及响应面优化并放大验证，S17发酵后棉籽粕中游离棉酚降低，本工艺发酵时间短、无需严格厌氧。凝结芽孢杆菌可产乳酸，抑制腐败菌，耐热且形成抗逆芽孢，能降低胃肠道感染风险，促进动物生长。利用S17固态发酵棉籽粕，实现了高效脱毒、富集粗蛋白与芽孢生产，发酵产物可作为优质饲料原料。
棉籽粕籽粕（CSM）是动物养殖业中一种重要的植物源蛋白质。然而，棉籽粕含有高水平的游离棉酚（FG），这是一种天然存在的动物毒素，限制了棉籽粕及其衍生物在动物饲料中的应用。游离棉酚会影响多种酶的功能，改变细胞膜特性，并干扰矿物质元素的利用。游离棉酚还会对反刍动物和单胃动物的雌雄繁殖能力产生影。此外，棉酚残留物对动物有毒，可转移至肉、奶和蛋中，危害人体健康。开发多种方法用于降解CSM中的FG。使用丙酮和乙醇等有机溶剂可从CSM中提取FG，从而降低CSM中的FG含量。然而，萃取法需要大量水，会导致蛋白质含量流失并降低蛋白质质量。另一种方法是促进FG与其他化合物结合。但其会导致动物饲料变色，降低适口性及其他CSM中的营养成分。
该文章旨在评估凝结魏茨曼氏菌在去除棉酚的同时提升棉籽粕营养价值和利用率的效果。我们分离并鉴定了36株凝结芽孢杆菌菌株，并利用其中发酵性能最优的一株建立了固态发酵工艺以降解棉籽粕中的游离棉酚。该工艺显著提高了棉籽粕的利用率，促进了棉籽粕在动物养殖中的应用。
（1）菌株的筛选与鉴定
为了获得性能优异的凝结魏茨曼氏菌分离株，我们首先从牛和羊的粪便样本中分离出凝结魏茨曼氏菌菌株。通过分离筛选和鉴定，共获得了36株凝结魏茨曼氏菌。随后，我们从NCBI数据库中提取了7株代表性凝结魏茨曼氏菌菌株的16S rRNA基因序列，与这36株分离的凝结魏茨曼氏菌菌株一起构建系统发育树。
新分离菌株与已知的凝结芽孢杆菌191号、ATCC 7050和R11亲缘较近。在36株菌中，多数具有淀粉酶活性，仅S6、S17、S24和Y53表现出弱纤维素酶活性，而S6、S17、Y53和Y56能利用全部11种测试糖类产酸。
在摇瓶培养中，S6、S17、Y51和Y54的活细胞与孢子浓度最高。固态发酵中，所有菌株对游离棉酚的降解率为40.58%–71.83%，其中S17的脱毒效率和活细胞浓度最高。因此选择S17进行后续发酵优化，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心（编号CCTCC M 2021965.2）。
（2）菌株耐受性与抗菌特性评估
为优化凝结魏茨曼氏菌S17固态发酵条件，考察了温度、料水比、接种量和时间对游离棉酚降解及菌株生长的影响。结果表明：温度30–55°C中，50°C时活菌浓度（2.60×10⁹ CFU/g湿料）和脱毒效率（68.08%）最高；55°C虽脱毒略增但活菌显著下降，故选用50°C。料水比1:0.6–1:1.4范围内，1:1时效果最佳（活菌2.80×10⁹ CFU/g，脱毒70.50%）。接种量2%–20%中，15%时达最大值（活菌2.80×10⁹ CFU/g，脱毒70.54%）。发酵时间0–48小时，脱毒与菌浓度持续升高，48小时达到峰值（活菌2.90×10⁹ CFU/g，脱毒74.90%）；48–72小时无进一步改善。0小时时23.70%的脱毒效率可能源自高压灭菌。
（3）混合菌株筛选及最佳接种比例
研究发现，添加葡萄糖、蔗糖、糖蜜、麸皮或膨化玉米粉（终浓度1%）均能显著提高凝结魏茨曼氏菌S17的活菌浓度，其中膨化玉米粉效果最佳；同时，葡萄糖、麸皮和膨化玉米粉显著提升游离棉酚脱毒效率。因此选择膨化玉米粉为最优碳源，最佳添加量为2%。无机盐试验显示，MgSO₄·7H₂O和FeSO₄可显著提高活菌浓度，K₂HPO₄和FeSO₄显著提升脱毒效率；综合考虑，选定FeSO₄为添加剂，最佳添加量为0.8%。
（4）单因素实验
采用Box-Behnken响应面法优化凝结魏茨曼氏菌S17固态发酵条件，考察料水比、接种量、发酵时间、膨化玉米粉含量及FeSO₄添加量（记为A、B、C、D、E）对活菌浓度（Y1）和游离棉酚脱毒效率（Y2）的影响。共进行43组试验，Y1范围为1.10×10⁹–7.45×10⁹ CFU/g湿料，Y2范围为75.77%–87.71%。多元回归分析显示，Y1模型R²=0.7596（p=0.0028），Y2模型R²=0.8542（p<0.0001），均显著。对Y1影响最显著的因素为发酵时间（C，p<0.0001）；对Y2影响最显著的因素为FeSO₄含量（E，p<0.0001）。
（5）普拉克特-伯曼实验设计
响应面分析表明，发酵时间（C）对活菌浓度影响显著（p<0.0001），且料水比（A）与膨化玉米粉含量（D）的交互作用也显著（p=0.0498）；FeSO₄含量（E）对游离棉酚脱毒效率影响显著（p<0.0001），其他因素交互作用不显著。模型预测最优条件为：料水比0.99、接种量15.32%、发酵时间52小时、膨化玉米粉1.98%、FeSO₄ 0.89%，此时预测活菌浓度达7.16×10⁹ CFU/g湿料，脱毒效率86.97%。验证实验表明，实际活菌浓度为6.42±0.31×10⁹ CFU/g湿料，芽孢浓度1.16±0.84×10¹⁰ CFU/g干料，脱毒效率86.01±1.09%。发酵后棉籽粕中游离棉酚从923.80±11.30 mg/kg降至129.20±10.03 mg/kg，粗蛋白从47.98±0.89%升至52.13±0.93%。
（6）爬坡和响应面结果
在40℃发酵车间采用条垛（60×35×10 cm）进行放大验证，活菌浓度为4.29±0.37×10⁹ CFU/g湿料，芽孢浓度8.28±0.72×10⁹ CFU/g干料，游离棉酚脱毒效率73.91±0.83%，粗蛋白含量由47.98±0.89%升至50.19±0.65%。因温度低于最佳且控温困难，效果低于实验室水平。为进一步提升性能，添加麸皮、MgSO₄、K₂HPO₄和MnSO₄，其中1%麸皮和0.5% K₂HPO₄显著提高脱毒效率与孢子形成，0.5% MgSO₄和0.3% MnSO₄增加孢子形成。将四因素纳入优化后再次放大验证，活菌浓度达6.67±0.34×10⁹ CFU/g湿料，孢子浓度1.68±2.81×10¹⁰ CFU/g干料，脱毒效率81.83±1.31%，粗蛋白含量升至52.82±1.05%。优化后各项指标均显著优于优化前放大实验，且除脱毒效率外亦优于Box-Behnken模型验证结果。
微生物固态发酵是降解棉籽粕中游离棉酚的重要方法。已有研究使用芽孢杆菌、酵母或乳酸菌，但存在产酒精、影响风味或改善营养效果不佳等问题。本研究分离的凝结魏茨曼氏菌与已知益生菌株（191号、ATCC 7050、R11）亲缘近，其中S17发酵和脱毒性能最佳。在50°C、料水比1:1等条件下，通过单因素及响应面优化并放大验证，凝结魏茨曼氏菌S17发酵后棉籽粕中游离棉酚降至167.90 mg/kg，脱毒率81.82%，粗蛋白增加4.83%，孢子浓度达1.68×10¹⁰ CFU/g干物质。与枯草芽孢杆菌（72 h脱毒79%）、乳酸菌（5 d脱毒约80%）及部分酵母（高压灭菌贡献脱毒）相比，本工艺发酵时间短、无需严格厌氧。凝结魏茨曼氏菌可产乳酸，抑制腐败菌，耐热且形成抗逆芽孢，能降低胃肠道感染风险，促进动物生长。综上，利用S17固态发酵棉籽粕，实现了高效脱毒、富集粗蛋白与芽孢生产，发酵产物可作为优质饲料原料。
彭楠（通讯作者）
彭楠，华中农业大学生命科学技术学院教授，博士生导师。主要研究方向（1）CRISPR-Cas系统功能机制及应用开发（2）益生菌筛选、改造、生产及其肠道功能研究。
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文案：边陈颖
编辑：边陈颖
审核：韩志东
河南科技大学
益生菌科学与技术团队
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