PBJ | 湖南农业大学刘仲华院士团队刘硕谦课题组发现茶树新型苦茶碱合成酶基因并揭示其关键调控模块

近日，湖南农业大学刘仲华院士团队-刘硕谦课题组在国际植物生物技术领域重要期刊 Plant Biotechnology Journal 在线发表了研究论文“Transcriptional Regulation of the Novel Theacrine Synthase Gene CsTcS2 by the CsTINY–CsWRKY33 Module Underpins Theacrine Biosynthesis in Camellia sinensis”。该研究面向茶树特色功能成分形成机制与优异种质创制的重大科学需求，首次从高苦茶碱茶树品种“KC3”中鉴定出新的苦茶碱合成酶基因 CsTcS2，并系统揭示 CsTINY–CsWRKY33–CsTcS2 模块协同调控苦茶碱生物合成的新机制，进一步完善了茶树苦茶碱形成的分子调控框架。该成果不仅在理论上深化了对茶树嘌呤生物碱代谢与调控规律的认识，也为高苦茶碱功能型茶树新品种培育、功能成分精准改良及健康茶产业创新发展提供了理论依据和技术支撑。

1.鉴定了新型苦茶碱合成关键基因CsTcS2 

研究通过全基因组比较和功能筛选，成功鉴定到茶树中新型苦茶碱合成关键基因 CsTcS2。功能分析表明，在烟草叶片中瞬时表达 CsTcS2 可催化底物生成苦茶碱；与咖啡碱脱氢酶 CsCDH 共表达时，可实现咖啡碱向苦茶碱的转化（图1）。在茶树中沉默和过表达实验证实CsTcS2 表达下调会抑制苦茶碱积累，而表达升高则有利于苦茶碱生成。上述结果说明CsTcS2 是茶树苦茶碱生物合成的关键结构基因（图2）。

2.CsTINY 通过转录激活 CsTcS2 正向调控苦茶碱生物合成

研究团队进一步聚焦 CsTcS2 的上游转录调控机制，从多个候选因子中锁定了 AP2/ERF 家族转录因子 CsTINY，其为 CsTcS2 启动子的高置信度结合候选蛋白。结合 AlphaFold3 结构建模分析，结果预测 CsTINY 与 CsTcS2 启动子区域之间存在高置信度空间关联。多个候选转录因子的双荧光素酶实验中，CsTINY 对 CsTcS2 启动子的激活效应最强；茶树叶片中沉默 CsTINY 后，CsTcS2 表达量和苦茶碱含量均明显下降。CsTINY 亚细胞定位定位于细胞核，酵母单杂交和 EMSA 实验证实其可直接结合 CsTcS2 启动子中的顺式作用元件并激活其转录（图3）。以上结果说明CsTINY 是茶树苦茶碱生物合成的重要正调控因子。

3.CsWRKY33 与 CsTINY 形成互作复合体

为探究CsTINY在茶树苦茶碱生物合成中的互作蛋白，研究以 CsTINY 为诱饵进行酵母双杂交筛选，鉴定到 WRKY 家族转录因子 CsWRKY33 是其潜在互作蛋白。分子对接分析显示CsTINY 与 CsWRKY33 之间能形成稳定复合体。酵母双杂交、荧光素酶互补、双分子荧光互补及 Co-IP 等实验从体外和体内两个层面系统验证了 CsTINY 与 CsWRKY33 在细胞核内存在稳定且特异的蛋白互作关系（图4）。这些结果说明在茶树苦茶碱生物合成调控过程中CsTINY 可能与 CsWRKY33 共同形成协同调控模块。

4.CsWRKY33 也通过转录激活 CsTcS2 正向调控苦茶碱生物合成

在明确互作关系后，研究分析了 CsWRKY33 是否直接参与 CsTcS2 的转录调控。结果表明，CsWRKY33 定位于细胞核；酵母单杂交实验显示其可与 CsTcS2 启动子发生特异结合，双荧光素酶实验表明其能够显著提高 CsTcS2 启动子活性，EMSA 证实其可直接识别并结合目标启动子区域。说明CsWRKY33 不仅是 CsTINY 的互作蛋白，同时也能直接激活 CsTcS2 的表达（图5）。说明CsWRKY33 也在茶树苦茶碱生物合成过程中发挥重要正调控作用。

5.CsTINY正向调控CsWRKY33的表达

进一步研究表明，CsTINY不仅能直接激活CsTcS2，还可结合CsWRKY33启动子并促进其表达。酵母单杂交、双荧光素酶和EMSA实验结果一致表明，CsTINY可直接结合CsWRKY33启动子并增强其启动子活性。茶树中沉默CsTINY会导致CsWRKY33转录水平下降，而过表达CsTINY则可显著提高CsWRKY33的表达量（图6）。表明CsTINY能直接结合CsWRKY33启动子并正向调控其表达。

6.CsWRKY33与CsTINY协同激活CsTcS2表达并促进苦茶碱积累

双荧光素酶实验显示，CsTINY与CsWRKY33共表达时CsTcS2启动子的激活作用明显强于二者单独表达。与此同时，沉默CsWRKY33不仅抑制了CsTcS2的表达，还降低了CsTINY的转录水平，并显著减少苦茶碱积累；相反，过表达CsWRKY33可提高CsTINY和CsTcS2的表达水平，同时促进苦茶碱积累（图7）。上述结果表明，CsWRKY33与CsTINY在CsTcS2表达调控中存在协同作用，并共同促进茶树中苦茶碱的生物合成。

作者及基金

湖南农业大学刘仲华院士、田娜副教授和刘硕谦教授为该论文通讯作者，黄建安教授参与研究指导；吴婷博士研究生为论文第一作者，朱丽桦硕士研究生为共同第一作者。博士研究生邵陈禹、谢思艺、李娜、晋慧影、尚方慧子，及硕士研究生李昕钰、汪芳、彭律文等参与了论文试验。该研究得到了国家重点研发计划项目（No.2021YFD1200203）、国家自然科学基金项目（U22A20500、32494780、32172629）和湖南省现代农业产业技术体系（HARS-10）的资助。

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