文献分享丨山东农业大学李媛媛团队解析氮素对苹果重要外在品质—表皮蜡质的调控机制

之前研究表明氮水平与蜡质生物合成呈负相关。为了进一步验证氮肥对蜡质含量的负面影响，对8年生的‘Gala/M26/Hanlus hupehensis’树分别用低氮LN、正常氮NN和高氮HN处理1年。果实成熟后摘取叶片和果实进行蜡质含量分析和扫描电镜观察。果实滴水试验表明，LN和NN处理下苹果果皮表面的水滴黏附力更强，说明LN和NN处理下果皮表面的疏水性比HN处理强（图1a-c）。这个结果说明随着氮肥施用量的增加，蜡质含量逐渐降低。用SEM分析了不同氮处理后的苹果叶片蜡质，结果表明HN处理抑制了蜡质的形成（图1f）。对处理后的叶片和果实中的总蜡质进行了提取，结果表明，LN和NN处理下的总蜡质含量高于HN处理（图1d，g）。采用气相色谱-质谱法（GC-MS）对蜡质组分进行了定量分析，发现NN和HN处理之间的差异：LN处理下C29长链烷烃含量最高，HN处理下C27长链烷烃含量较高（图1e，h）。这一结果表明N对C27-C31烷烃的影响最为显著；过量施氮导致苹果中C27含量升高，但未能改变以C29为主的烷烃含量。

为了验证N对苹果抗旱性和茎直立度的影响是否完全或部分取决于蜡质含量的变化，在自然条件下对湖北海棠（一种苹果品种）的砧木施加LN（0.1mM）、NN（1mM）和HN（10mM）处理。同时，在LN处理中使用乙草胺（一种已报道的蜡质合成抑制剂），在HN处理中使用VLCFAs混合物，以更好地阐明蜡质在此过程中的作用。结果表明，在干旱处理下，HN处理的植物长势较差，而LN和NN处理的植物长势较好。添加乙草胺后，干旱条件下LN处理的植物比单独LN处理的植物更弱。同时，与单独HN处理相比，添加VLCFAs的HN植物较弱的表型得到部分恢复。结果表明，LN处理可以提高苹果的抗旱性，并且N对植物抗旱性的影响部分取决于蜡质（图1i）。此外，茎直立性测定表明，随着N浓度的增加，茎弯曲的角度逐渐增加，在HN处理中观察到最大程度的弯曲；施用VLCFA后，弯曲得到恢复。这一结果同样表明，N影响的茎弯曲部分依赖于蜡质（图1j-l）。总之，这些结果表明基于N的表型至少部分依赖于蜡质积累。

图1.N负向调控苹果蜡质的积累。（a）用HN、NN和LN浓度处理的苹果果实表型。（b,c）用不同N浓度处理的水果表面与水滴之间的接触角的照片(b)和测量值(c)。（d,e）用不同N浓度处理的果实的总蜡负荷(d)和烷烃(e)。（f）用不同N浓度处理的叶片蜡质晶体的SEM图像。Bar，2μm。（g,h）用不同N浓度处理的叶片的总蜡负荷(g)和烷烃(h)。（i）HN、NN、LN、LN与乙草胺以及HN与VLCFA混合物处理对苹果幼苗干旱程度的影响。（j）HN、NN、LN、LN与乙草胺以及HN与VLCFA混合物处理对苹果幼苗直立程度的影响。（k）HN、NN、LN、含乙草胺的LN和含VLCFA混合物的HN处理的叶片和茎蜡质晶体的SEM图像。Bar，10μm。（l）茎倾斜角的定量统计。*表示通过Student’s t检验（双侧）评估的显著差异。***P<0.001；**P<0.01；*P<0.05；NS，不显著。对于条形图，通过单因素方差分析（使用Tukey检验）评估，不同字母表示具有显著差异（P<0.01）。

先前的研究表明，BTB支架蛋白MdBT2对N信号有响应（图2a）。因此，我们研究了其潜在机制，以确定N诱导的蜡质积累是否与MdBT2活性有潜在联系。使用MdBT2反义转基因苹果（antiMdBT2）叶片和果实分析蜡质的形态、晶体、含量和成分。SEM结果表明，GL3（野生型(WT)）和转基因苹果叶片中的蜡质形态相似，但antiMdBT2转基因株系中的晶体数量明显高于GL3（图2b）。MdBT2抑制增加了苹果叶片和果实中的总蜡质含量（图2c-e）。随后，通过GC-MS进一步分析了蜡质成分。与GL3相比，antiMdBT2叶片和果实中大多数烷烃是主要增加的成分（图2c、e）。还分析了抗MdBT2、MdBT2过表达（MdBT2-OE）和GL3苹果幼苗叶片中的蜡质晶体、含量和成分以及相关基因表达，结果表明，MdBT2可以通过调节蜡质相关基因来负向调节苹果蜡质含量。

为了研究蜡质的形成，我们进行了酵母双杂交(Y2H)筛选，以鉴定MdBT2相互作用蛋白。几种蛋白被鉴定为MdBT2的下游蛋白，包括R2R3-MYB MdMYB106。此外，还进行了蛋白质印迹分析，并使用抗HA（流感血凝素表位）和抗MYC（v-myc骨髓增生性疾病病毒致癌基因）抗体检测了不同酵母菌株中的蛋白质水平（图2f）。结果显示全长MdBT2和全长MdMYB106之间存在强相互作用。然而，在MdBT2和MdMYB106中的调节和催化结构域之间没有观察到相互作用，这表明这两个序列的所有结构域对于MdMYB106–MdBT2相互作用都是必需的。利用免疫共沉淀(Co-IP)、体外下拉试验（pull-down试验）和双分子荧光互补(BiFC)试验进一步研究了相互作用。Co-IP试验表明MdMYB106和MdBT2在体内发生了相互作用，pull-down试验显示MdMYB106-His与抗His抗体有明显的结合，而BiFC试验表明MdMYB106和MdBT2的相互作用发生在细胞核中（图2g-i）。

图2.MdBT2在体内和体外通过与MdMYB106相互作用对蜡质生物合成产生负面影响。（a）不同氮供应下MdBT2的相对表达水平。（b）GL3和antiMdBT2叶片蜡质晶体的SEM图像。Bar，50μm。（c）GL3和antiMdBT2叶片的总蜡负荷和烷烃。（d）GL3和antiMdBT2果实的水滴分析。（e）GL3和antiMdBT2果实的总蜡负荷和烷烃。（f）分段Y2H分析以验证MdBT2和MdMYB106之间的相互作用，并采用蛋白质印迹分析来验证每个菌株中的蛋白质表达。（g）体外用MdBT2-GST和MdMYB106-His进行下拉实验。（h）体内Co-IP试验验证MdBT2和MdMYB106与Anti-GFP和Anti-MYC抗体之间的相互作用。（i）体内BiFC试验测试MdMYB106与MdBT2之间的相互作用。然后，使用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)作为核标记。YFP，黄色荧光蛋白；BF，明场；MERGE，YFP、DAPI和BF的合并视图。（f-h）中的实验至少独立重复了三次，结果相似。对于条形图，通过单因素方差分析（使用Tukey检验）评估，不同字母表示具有显著差异（P<0.01）。