文献分享丨中国农业大学李金杰团队揭示水稻CTB5自然变异促进高原粳稻冷适应性的遗传基础和分子机制

图1.CTB5对孕穗期的抗寒性至关重要。（a）qCTB7的纯合重组体及其抗寒性能。数据代表平均值±标准差。在条形图上标明了用于表型的个体的数量（n）。（b）高海拔地区(CS-HAA)寒冷胁迫下NIL^CTB5和Towada的田间表现比较。（c、d）正常条件(NC)和CS-HAA条件下(c)以及深水(CS-DW)寒冷胁迫下和植物生长室(CS-PT)条件下（d）NIL^CTB5和Towada的结实率。数据代表平均值±标准差（NC和CS-HAA为n=15株植物，CS-DW和CS-PT为n=11株植物）。（e）NIL^CTB5和Towada在寒冷处理期间不同时间点的CTB5相对表达水平。数据代表平均值±SD（n=3个生物学重复）。（f、g）CS-HAA处理下Towada和CTB5互补系的田间表现（f）和穗（g）比较。比例尺g=2cm。（h、i）CS-HAA（n=20/18/18株）（h）CS-DW（n=15/15/10株）和CS-PT（n=15/15/15株）（i）下Towada和CTB5互补系的结实率。（j、k）CS-HAA（n=23/22/19/22/18株）（j）CS-DW（n=13/24/15/10/10株）和CS-PT（n=10/20/12/12/12株）（k）下Towada和CTB5过表达系的结实率。（l、m）CS-HAA胁迫下Towada和CTB5过表达系的田间表现（l）和穗（m）比较。比例尺m=2cm。（n）CS-HAA胁迫下Nipponbare和CTB5敲除系的田间表现（n）和穗（o）比较。比例尺o=2cm。（p、q）CS-HAA（n=15株植物）（p）CS-DW（n=10株植物）和CS-PT（n=10株植物）（q）下Nipponbare和CTB5敲除系的结实率。在(a、c-e)中，星号表示双尾Student’s t检验的统计学意义（**P<0.01，***P<0.001，数据代表平均值±标准差）。在(h–k，p、q)中，不同的小写字母表示通过Duncan多重范围检验的单因素方差分析在P=0.05处具有统计学显著差异，误差线表示平均值±标准差。

外源应用试验表明，低温下施用赤霉素（GA）可提高CTB5敲除植物和过表达植物的结实率（图2a、b）。为了研究CTB5是否参与GA途径，我们用HPLC-MS/MS测量了正常和寒冷胁迫条件下CTB5转基因型和野生型植物花药中各种GA成分的水平。GA₁、GA₃、GA₄和GA₇是水稻中主要的活性GA，其组织分布不同：GA₁和GA₃主要在营养器官中，而GA₄和GA₇主要在生殖器官中。此外还观察到花药中GA₄和GA₇的含量明显高于GA₁和GA₃（图2c、d）。在正常条件下，CTB5敲除型、过表达型和野生型植物之间没有发现活性GA水平的显著差异（图2c、d）。然而，在16℃下冷处理7天后，所有植物类型的GA₄和GA₇水平均显著降低，敲除植物的水平低于Nipponbare，而过表达植物的水平高于Towada（图2c、d）。同样，中间前体GA₉和GA₁₅以及产物GA₃₄的水平在CTB5敲除植物中低于Nipponbare，在过表达植物中高于Towada（图2e-h）。相反，GA₁、GA₃、它们的中间前体GA₁₉和GA₂₀以及产物GA₈的水平在两种条件下始终较低，CTB5敲除型、过表达型和野生型植物之间的水平相似（图2c-h）。这些结果表明CTB5介导GA稳态并促进寒冷胁迫下花药中生物活性GA的积累。

为了阐明CTB5在孕穗期调控GA介导的抗寒性的机制，我们使用转录组分析和qRT-PCR鉴定出CTB5通过调控基因OsGA2ox6和OsGA3ox1从而调控GA介导的抗寒性。为了测试CTB5是否直接调节OsGA2ox6和OsGA3ox1，我们分析了这两个基因的启动子并确定了保守位点（TAATTA）基序。酵母单杂交(Y1H)试验表明CTB5与OsGA2ox6和OsGA3ox1的启动子片段直接相互作用(图2i，m)。DNA电泳迁移率变动试验(EMSA)表明CTB5MBP融合蛋白可以与含有TAATTA基序的探针结合，但不能与突变的探针结合(图2j，n)。染色质免疫沉淀(ChIP)分析证实，只有含有TAATTA基序的片段显著富集(图2k，o)。双荧光素酶报告基因检测显示，CTB5抑制OsGA2ox6并激活OsGA3ox1，且CTB5^KM的调控作用强于CTB5^Tow（图2l，p）。此外，OsHox12和CTB5共表达显著抑制了OsGA2ox6的LUC表达并增强了OsGA3ox1的LUC表达，表明OsHox12促进了CTB5对这两个基因的调控作用（图2q-t）。

图2.CTB5通过直接调节OsGA2ox6和OsGA3ox1来调节花药中的赤霉素（GA）水平。（a、b）在施用和不施用GA的情况下暴露于冷胁迫的CTB5敲除(a)和过表达(b)植物的结实率。数据代表平均值±标准差（a中n=11/9、10/9株植物，b中n=10/10、10/10、7/7株植物）。（c-h）在正常条件（NC）和冷胁迫（CS）条件（16℃，7天）下CTB5敲除和过表达植物正在发育的花药中的GA含量。数据代表平均值±标准差（n=3个生物学重复）。（i、m）酵母单杂交试验测试CTB5与OsGA2ox6(i)和OsGA3ox1(m)启动子的结合。EV，空载体。（j、n）EMSA检测表明CTB5与OsGA2ox6(j)和OsGA3ox1(n)启动子的TAATTA基序结合。（k、o）ChIP-qPCR检测表明CTB5在体内与OsGA2ox6(k)和OsGA3ox1(o)启动子结合。数据代表平均值±标准差（n=3个生物学重复）。（l、p）双荧光素酶报告基因检测证实CTB5与水稻原生质体中的OsGA2ox6(l)和OsGA3ox1(p)启动子结合。EV，空pGreenII62-SK载体。数据代表平均值±标准差（l为n=5个生物学重复，p为n=4个生物学重复）。（q-t）双荧光素酶报告基因检测显示，OsHox12增强了CTB5对水稻原生质体（q，s）和烟草叶片（r，t）中OsGA2ox6和OsGA3ox1的调控作用。EV，空pGreenII62-SK载体。数据代表平均值±标准差（q和s的n=4个生物学重复，r和t的n=5个生物学重复）。在（i–t）中，显示了来自至少两个独立实验的代表性实验。在（a、b、k、o）中，星号表示通过双尾Student’s t检验的统计学显着性(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。在(c–h，l，p–t)中，不同的小写字母表示通过单因素方差分析和Duncan多范围检验在P=0.05处具有统计学显着差异。