2025年1月“Cell”杂志发表了中国农业大学杨淑华老师团队的研究论文。该文章揭示玉米适应高纬度低温环境的分子机制，发现玉米COOL1基因的自然变异增强了低温耐受性，促进其适应高纬度低温环境。
通过对205个自交系玉米品种的表型评估，发现不同遗传资源在4℃低温处理下的叶片损伤程度存在显著差异，其中SS亚群表现出最高的耐冷性。利用全基因组关联分析（GWAS），研究团队在玉米第3号染色体上发现了一个显著峰值，该区域内的五个SNPs与叶片损伤程度显著相关，且均位于bHLH转录因子基因COOL1的启动子区域。进一步的重测序和关联分析揭示了另外四个与耐冷性相关的SNPs，这些SNPs与之前的五个SNPs高度连锁。基于这些SNPs，研究将205个玉米基因型分为耐冷单倍型HapA和冷敏感单倍型HapB，其中HapB基因型的COOL1表达水平较高，表明COOL1表达与耐冷性呈负相关。为验证COOL1的功能，研究构建了携带COOL1HapA等位基因的近等基因系（NIL），并发现NIL-COOL1HapA植株的耐冷性显著增强。此外，通过CRISPR-Cas9基因编辑技术构建的COOL1敲除突变体也表现出更高的耐冷性，而COOL1过表达植株则表现出耐冷性下降。这些结果表明，COOL1在玉米幼苗期耐冷性中起负调控作用。然而，COOL1对种子萌发阶段的耐冷性没有显著影响。综上所述，COOL1通过调控其表达水平影响玉米幼苗的耐冷性，为玉米耐冷育种提供了重要的遗传资源。
同时探讨了bZIP转录因子HY5在玉米耐冷性中的调控作用及其与COOL1基因的相互作用。发现，与耐冷性显著相关的四个SNPs（SNP-1183、SNP-1182、SNP-1180和SNP-1178）位于COOL1启动子区域的A-box基序（TACGTA）内，该基序是bZIP转录因子的结合位点。通过分析冷响应转录组数据，发现HY5（bZIP61）在冷处理下表达显著上调。进一步实验表明，过表达HY5的转基因玉米植株表现出增强的耐冷性，而HY5敲除突变体则对冷胁迫更敏感，证实HY5正向调控玉米耐冷性。
通过染色质免疫共沉淀（ChIP-qPCR）和电泳迁移率实验（EMSA），发现HY5与COOL1HapA启动子中的A-box基序结合亲和力显著高于COOL1HapB，表明四个SNPs影响了HY5的结合能力。双荧光素酶报告实验进一步显示，HY5能够显著抑制COOL1HapA启动子的活性，且在冷处理后抑制作用更强，而COOL1HapB启动子对HY5和冷处理不敏感。在植物体内实验中，冷胁迫下HY5敲除突变体中COOL1表达升高，而HY5过表达植株中COOL1表达降低。此外，HY5和COOL1共过表达植株表现出与COOL1过表达植株相似的冷敏感性，而cool1 hy5双突变体的耐冷性与cool1单突变体相似，表明HY5通过负调控COOL1表达来正向调控玉米耐冷性。这些结果揭示了HY5-COOL1模块在玉米耐冷性中的关键作用。
通过RNA-seq和ChIP-seq分析，鉴定了COOL1调控的冷响应基因（COR），发现COOL1直接靶向1,408个基因，包括DREB1和TPS基因家族成员。COOL1通过结合这些基因启动子区域的G-box基序，抑制其表达。试验表明，COOL1敲除突变体中DREB1和TPS基因表达上调，而COOL1过表达植株中这些基因表达下调。TPS13过表达植株表现出增强的耐冷性。综上，COOL1通过直接抑制DREB1和TPS基因的表达，负调控玉米耐冷性。
同时发现，COOL1在玉米原生质体中主要定位于细胞核和细胞质，冷处理不影响其定位，但会提高其转录和蛋白水平。通过LC-MS/MS分析，鉴定出COOL1与CPK17相互作用，冷处理后CPK17从细胞质转移到细胞核。CPK17过表达植株耐冷性降低，而cpk17敲除突变体耐冷性增强，表明CPK17负调控玉米幼苗的耐冷性。本研究揭示了CPK17通过磷酸化调控COOL1蛋白稳定性，进而影响玉米耐冷性的分子机制。通过体外磷酸化实验，研究发现CPK17能够磷酸化COOL1，并鉴定出COOL1的Thr-124位点为关键磷酸化位点。在植物体内，冷胁迫诱导CPK17激酶活性增强，并促进CPK17从细胞质向细胞核转移，而COOL1的定位不受冷处理影响。冷处理后，COOL1蛋白水平显著增加，且CPK17过表达植株中COOL1蛋白更稳定，而cpk17突变体中COOL1降解加快，表明CPK17通过磷酸化COOL1抑制其泛素化介导的降解。
进一步试验结果表明，CPK17通过磷酸化COOL1的Thr-124位点，阻止其被26S蛋白酶体降解。在玉米原生质体中，CPK17的表达量与COOL1蛋白水平呈正相关，而COOL1T124A突变体蛋白稳定性显著降低。冷处理后，CPK17过表达植株中COOL1蛋白水平显著升高，而cpk17突变体中COOL1蛋白水平降低，进一步证实CPK17通过磷酸化增强COOL1稳定性。
遗传分析显示，cpk17突变体表现出增强的耐冷性，而COOL1过表达植株对冷胁迫更敏感。cpk17 COOL1-OE植株的耐冷性与COOL1-OE植株相似，表明CPK17通过调控COOL1蛋白稳定性负调控玉米耐冷性。综上所述，CPK17在冷胁迫下通过磷酸化COOL1的Thr-124位点，增强其稳定性，从而负调控玉米幼苗的耐冷性。
研究发现，耐冷单倍型COOL1HapA在玉米野生近缘种大刍草中已存在，约60%的parviglumis和47%的mexicana携带该等位基因。对1008份美洲玉米地方品种的基因型分析显示，COOL1HapA在高纬度地区（如美国）频率较高，而冷敏感单倍型COOL1HapB主要分布在低纬度地区，表明COOL1可能在玉米适应北方高纬度环境中发挥了重要作用。
该文章的创新点：
（1）鉴定出COOL 1基因作为玉米冷耐受性的关键负调控因子。
（2） 阐明了COOL1基因如何通过启动子变异、转录因子结合、激酶磷酸化等多层次调控机制影响玉米的冷耐受性 。
（3）提供了COOL1基因在玉米高纬度适应中的重要作用及其分子机制的证据。
https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.12.018
