虽然通过先进的育种技术加速了生产性状的遗传改良，但疾病抗性表型仍然对畜牧业育种系统构成重大挑战。目前的基因编辑技术提供了一种有效和生物安全的策略，通过精确操纵宿主抗病毒基因来增强畜牧业疾病抗性。
2026年3月2日，华南农业大学研究团队在PLOS PATHOGENS上发表题为“TRIM29 knockout pigs exhibit enhanced broad-spectrum disease resilience by amplifying type I interferon antiviral defenses”的最新研究论文。本研究成功地产生了对多种病毒表现出广谱抗病毒活性的抗病猪，没有观察到对猪健康的不利影响。
IF：5.5 中科院1区 | JCR/Q1 微生物学 参考译文：TRIM29基因敲除猪通过增强I型干扰素抗病毒防御表现出增强的广谱疾病恢复力 第一作者：Xiaohui Yang 通讯作者：Huaqiang Yang , Zhenfang Wu |
1.TRIM29调节PK15细胞中的PRV感染
研究结果显示，PRV感染可显著诱导PK15细胞中TRIM29 mRNA和蛋白水平的表达上调。通过siRNA介导的TRIM29敲低实验发现，抑制TRIM29表达能够显著增强PRV感染诱导的IFNβ产生，同时细胞内PRV DNA拷贝数和上清液病毒滴度均明显降低。相反，过表达TRIM29则显著抑制cGAMP和PRV诱导的IFNβ转录，进而促进病毒复制。深入的机制研究表明，TRIM29通过靶向cGAS-STING信号轴发挥负调控作用：在PRV感染条件下，TRIM29敲低可显著增加STING蛋白稳定性，促进TBK1和IRF3的磷酸化激活；而TRIM29过表达则促进STING降解，抑制下游信号通路激活。病毒动力学研究进一步证实，无论在低感染复数（MOI=0.1）还是高感染复数（MOI=1）条件下，TRIM29敲低均持续抑制PRV复制，而过表达则促进病毒增殖。
图1.TRIM29通过抑制I型IFN的产生支持PRV感染与DNA病毒PRV感染不同，VSV感染导致PK15细胞中TRIM29 mRNA水平下调，同时诱导超过150倍的IFNβ表达上调。通过siRNA介导的TRIM29敲低实验发现，抑制TRIM29表达可显著增强VSV诱导的IFNβ产生，而对基础IFNβ水平无影响。这种增强的抗病毒反应与VSV复制能力下降相关，表现为培养上清中病毒拷贝数和滴度明显降低，EGFP荧光示踪也证实VSV阳性细胞减少。相反，TRIM29过表达则减弱VSV诱导的IFNβ表达，促进病毒复制。病毒动力学研究显示，在不同感染复数条件下，TRIM29敲低持续抑制VSV增殖，而过表达则促进病毒复制。机制研究表明，与预期不同，VSV感染条件下MAVS蛋白水平在TRIM29敲低或过表达细胞中均无明显变化，提示MAVS可能不是PK15细胞中TRIM29调控VSV感染的关键下游效应分子。值得注意的是，在VSV感染条件下，TRIM29仍能调控STING蛋白表达，进而影响TBK1-IRF3信号轴的激活。图2.TRIM29通过抑制I型IFN的产生促进VSV感染3.Trim 29-KO小鼠对PRV和VSV感染具有弹性
基因型鉴定和免疫印迹分析证实了Trim29基因的成功敲除及蛋白表达的完全缺失。有趣的是，生长发育监测显示，纯合Trim29-KO小鼠在断奶前表现出显著优于杂合KO和野生型（WT）同窝小鼠的体重增长趋势，而断奶后三组生长速率趋于一致。在PRV皮下攻毒实验中，纯合KO小鼠表现出明显减轻的临床症状和显著降低的死亡率，其脑组织中IFNα和IFNβ mRNA水平选择性升高，同时脑和肺组织中的PRV病毒载量显著低于对照组。在VSV攻毒实验中，纯合Trim29-KO小鼠展现出更强的抗病毒表型，在整个12天观察期内实现完全存活（0%死亡率），而杂合KO和WT组存活率约为57%。与存活表型一致，纯合KO小鼠脑组织中IFNα和IFNβ显著上调，脑组织和血清中的VSV病毒拷贝数明显降低。图3.Trim 29-KO小鼠的建立及其抗病毒能力的评估4.通过基因编辑和动物克隆产生TRIM 29-KO猪
研究团队首先设计靶向TRIM29基因第一外显子的gRNA，转染猪胎儿成纤维细胞（PFF）后筛选获得双等位基因发生插入缺失（indels）的编辑细胞系作为供体细胞。随后进行体细胞核移植，共将胚胎移植至10头受体母猪，其中5头成功妊娠，最终获得31头克隆仔猪，26头健康存活。生长发育观察显示，TRIM29-KO克隆猪在后续饲养过程中未见明显发育异常或健康问题。基因型分析证实，所有克隆猪均携带与供体细胞相同的双等位基因编辑：一个等位基因发生1-bp插入，另一个发生1-bp缺失。鉴于TRIM29在皮肤组织中高表达，研究团队通过耳部皮肤活检进行免疫印迹验证，结果显示克隆猪皮肤中TRIM29蛋白完全检测不到，而野生型对照则呈现强表达，从蛋白水平确认了基因敲除的成功。安全性评估方面，研究团队利用Cas-Offinder和CRISPR软件预测了多达934个潜在脱靶位点，通过对TRIM29-KO猪进行全基因组测序并将数据比对至猪参考基因组（SSC11.1），对候选脱靶位点进行PCR扩增和Sanger测序验证，结果未检测到可识别的脱靶突变。研究人员将6头KO猪和15头品种匹配的5月龄野生型（WT）猪经鼻接种PRV病毒液（每鼻孔5 mL，滴度为1×10^6.9 TCID50/100 μL），并连续监测临床症状和体温变化。结果显示，KO组猪临床症状明显减轻，活动状态更佳，体温反应更平缓，死亡率显著低于WT组。至感染后第9天实验终点，15头WT猪中仅3头存活且呈现濒死状态，而6头KO猪中3头存活且临床表现正常。病毒学分析表明，KO猪在整个感染期间的口腔排毒水平持续低于WT组，脑组织和肺组织中的病毒载量显著降低，血清病毒载量在感染后第7天也呈现降低趋势。血清学检测显示，KO猪在感染后第7和9天的PRV gB和gE抗体水平均明显低于WT组，与其较低的病毒载量和减轻的疾病严重程度一致。进一步的细胞因子分析发现，KO猪血清中IFNα和IFNβ水平在病毒感染后持续高于WT组，脑组织中IFNα和IFNβ mRNA表达显著上调，ISG基因（MX1和ISG15）也呈现升高趋势。组织病理学检查显示，WT猪肺部呈现肺泡壁增厚伴炎细胞浸润，脑组织出现血管周围套袖现象；而KO猪组织病变明显减轻。免疫组化染色证实，WT猪脑和肺组织中PRV抗原信号更强且分布更广。图6.猪伪狂犬病病毒感染后Ⅰ型干扰素信号和组织病理学变化6.TRIM 29-KO猪源PAM对多种病毒具有弹性鉴于I型干扰素具有广谱抗病毒特性，研究人员对PRV（DNA病毒）、VSV（RNA病毒）和TGEV（冠状病毒）三种不同病毒进行了攻毒实验。结果显示，与野生型（WT）PAMs相比，TRIM29-KO PAMs在PRV感染后诱导了更高的IFNα和IFNβ表达，同时病毒滴度显著降低。类似的结果在VSV感染中得到验证：KO PAMs中I型干扰素水平升高，VSV复制能力下降。进一步对猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）的感染实验表明，KO PAMs同样表现出增强的抗病毒能力，IFNα和IFNβ mRNA水平显著上调，病毒滴度降低。病毒动力学研究在不同感染复数（MOI=0.1和1）条件下进一步证实，PRV、VSV和TGEV三种病毒在KO PAMs中的复制动力学均受到明显抑制。这些结果一致表明，TRIM29-KO猪来源的PAMs通过增强的I型干扰素信号，对多种病毒病原体均表现出显著提高的抵抗力，不仅包括DNA病毒（PRV），还包括RNA病毒（VSV）和冠状病毒（TGEV），充分体现了TRIM29缺失赋予的广谱抗病毒效应。图7.从TRIM 29-KO猪分离的PAM对多种病毒具有弹性7.TRIM 29-KO小鼠和猪没有表现出升高的炎症水平对1月龄仔猪血清的多因子检测显示，TRIM29-KO猪与野生型（WT）对照组相比，包括IFNα、IFNγ、IL-1β、IL-6、TNFα在内的多种关键促炎和抗炎细胞因子浓度均处于相当水平，仅IL-8在KO组中呈现显著下调。体液免疫参数方面，两组间IgG、IgA、IgM免疫球蛋白水平无显著差异。对5周龄小鼠血清的分析表明，Trim29-KO小鼠的促炎因子TNFα、IFNγ和IL-17A浓度甚至低于对照组，而IL-1β、IL-6、IL-10等未见改变；免疫球蛋白谱系中仅IgA水平降低，其余亚型均无显著变化。为进一步评估病理条件下的炎症反应，研究人员利用脂多糖（LPS）诱导PAMs炎症模型。结果显示，在LPS刺激12小时后，KO和WT PAMs的促炎因子（TNFα、IL-1β、IL-6）及炎症标志物COX2的mRNA表达水平无显著差异；蛋白水平检测也证实pro-TNFα、pro-IL-1β和COX2的表达量在两组间相当。这些多层次的证据表明，TRIM29-KO小鼠和猪在生理条件下不呈现系统性炎症水平升高，甚至在部分指标上表现出更低的炎症基调；在LPS诱导的急性炎症刺激下，KO细胞也未出现过度的炎症反应。图8.TRIM 29-KO与WT猪和小鼠模型中炎症和免疫学特征的比较分析本研究首次系统揭示了E3泛素连接酶TRIM29作为I型干扰素信号通路的负调控因子，在猪抗病毒免疫中的关键作用。通过体外细胞实验证实，TRIM29敲低可显著增强PK15细胞对DNA病毒PRV和RNA病毒VSV的抗感染能力，其机制主要依赖于对STING蛋白的稳定性调控，进而激活TBK1-IRF3信号轴，促进I型干扰素产生。这一发现突破了传统认知中TRIM29仅特异性调控DNA或RNA病毒通路的局限，证明其通过靶向STING这一共同节点实现对广谱病毒的感受与调控。
为进一步验证体内抗病毒效果，研究团队成功构建了Trim29基因敲除小鼠模型，并在此基础上通过CRISPR/Cas9基因编辑结合体细胞核移植技术，成功培育出TRIM29基因敲除猪。活体攻毒实验表明，TRIM29-KO猪对PRV感染表现出显著增强的抵抗力，临床症减轻、死亡率降低、病毒载量下降，且血清和组织中I型干扰素水平持续升高。更为重要的是，从KO猪分离的原代肺泡巨噬细胞对PRV、VSV和TGEV三种不同类型病毒均呈现广谱抗感染能力，充分体现了TRIM29缺失赋予的广谱抗病毒效应。
源论文链接：https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1014023 M
编辑：九九
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