PPB·5.7|南京农业大学徐彬教授团队揭示柳枝稷干旱诱导型启动子PvHVA1pro精准调控靶基因表达的分子机制

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研究结果

3.1. 不同非生物胁迫下PvHVA1的表达谱分析

• 序列比对：根据柳枝稷基因组序列信息对PvHVA1的全长CDS序列进行了BLAST比对分析。

• 表达模式：光暗周期下PvHVA1表达无显著差异，表明其不受昼夜节律调控；PEG诱导的渗透胁迫强烈诱导其表达（处理4小时达5833倍）；NaCl和低温处理轻微诱导其表达；ABA处理中度诱导其表达（处理8小时达124倍）。

为探究PvHVA1对不同非生物胁迫的响应，本研究测定了柳枝稷幼苗在光暗周期及PEG、低温、NaCl和ABA处理下的转录水平。结果表明，PvHVA1的表达不受昼夜节律调控，但在渗透胁迫下表现出高度的可诱导性，同时对盐、低温和ABA处理也有不同程度的响应（Fig. 1）。

图1. PvHVA1的表达谱和启动子分析。 (A) 光暗周期下PvHVA1的相对表达量。(B-E) qRT-PCR测定PEG (B)、NaCl (C)、低温 (D) 和ABA (E) 处理下PvHVA1的相对表达量。对于每种处理，表达水平以对照（设为1）进行归一化，数据代表三个生物学重复的平均值±SE。每列上方的不同字母表示平均值之间存在显著差异（p < 0.05）。(F) PlantCARE网站预测的PvHVA1启动子中的顺式调控元件。

3.2 柳枝稷干旱诱导型PvHVA1启动子的表征

• 克隆与预测：从柳枝稷中分离了PvHVA1起始密码子ATG上游1727 bp的序列，并预测出39个潜在的顺式调控元件，涵盖非生物胁迫、光和激素响应元件。

• 活性验证：通过农杆菌介导法获得了PvHVA1pro::GUS稳定转基因柳枝稷。正常条件下未观察到GUS染色；干旱处理7天和14天后，转基因植株的根、茎、叶中出现逐渐加深的GUS染色，而恢复供水后染色消失；GUS酶活性测定结果与染色表型高度一致。

为评估PvHVA1的启动子活性，本研究克隆了其上游调控序列并进行了顺式元件分析。随后，通过构建PvHVA1pro::GUS转基因柳枝稷植株并结合GUS组织化学染色及酶活性定量测定，证实了该启动子在最适生长条件下基础表达量极低，但在干旱胁迫下被强烈诱导，且在水分恢复后具有表达可逆性（Fig. 2, Fig. 3）。

图2. PvHVA1pro::GUS和PvHVA1pro::PIP2;9转基因柳枝稷的鉴定。 (A) 转化入柳枝稷的质粒构建示意图。LB，左边界；RB，右边界；35S pro，CaMV35S启动子；PvHVA1 pro，PvHVA1启动子；HptII，潮霉素磷酸转移酶II基因；HygR，潮霉素抗性；NosT，Nos终止子。(B) PvHVA1pro::GUS和PvHVA1pro::PIP2;9转基因柳枝稷的PCR验证。M，Marker；PC，阳性对照；WT，野生型柳枝稷；#1-#8，转基因株系编号。

图3. 水分亏缺条件下柳枝稷中PvHVA1启动子的活性分析。 (A) PvHVA1pro::GUS转基因柳枝稷的GUS组织化学染色。取下根、茎和叶，在对照、干旱7天和14天以及水分恢复条件下，在X-gluc溶液中孵育12小时。叶绿素用70%乙醇脱色。比例尺 = 5 mm。(B) PvHVA1pro::GUS转基因柳枝稷的GUS活性。数据代表三个生物学重复的平均值±SE。每列上方的不同字母表示平均值之间存在显著差异（p < 0.05）。

3.3 由干旱诱导型PvHVA1启动子驱动的PvPIP2;9表达提高了柳枝稷的耐旱性

为评估PvHVA1启动子在水分亏缺条件下的应用潜力，本研究利用其驱动水通道蛋白基因PvPIP2;9在柳枝稷中表达。结果表明，干旱诱导的PvPIP2;9表达显著改善了植株的生理状态并提高了耐旱性，且在复水后展现出优于组成型表达的恢复能力。同时，该靶向表达模式还导致了转基因植株叶夹角减小的直立表型特征（Fig. 4, Fig. 5）。

图4. 在PvHVA1启动子控制下表达PvPIP2;9提高了柳枝稷在水分亏缺胁迫下的耐旱性。 (A) PvHVA1pro::PIP2;9转基因柳枝稷和WT植株分别在对照和干旱处理下的表型。2.5个月大的柳枝稷在水分充足和停止浇水21天的条件下生长。比例尺 = 10 cm。(B) 叶片相对含水量。(C) 叶片叶绿素含量。(D) 叶片渗透势。(E) 叶片电解质渗漏。数据代表三个生物学重复的平均值±SE。每列上方的不同字母表示平均值之间存在显著差异（p < 0.05）。

图5. 在PvHVA1启动子控制下表达PvPIP2;9减小了柳枝稷的叶夹角。 (A) 转基因和WT植株的叶夹角表型。比例尺 = 1 cm。(B) PvHVA1pro::PIP2;9转基因和WT植株的叶夹角。数据代表至少九个重复的平均值±SE。每列上方的不同字母表示平均值之间存在显著差异（p < 0.05）。(C) 干旱条件下PvHVA1pro::GUS转基因柳枝稷叶夹角/叶鞘区域的GUS组织化学染色。比例尺 = 3 mm。

3.4 PvHVA1pro::PvPIP2;9的表达提高了水分亏缺条件下的光合效率和水分利用效率

进一步研究了由PvHVA1pro驱动的PvPIP2;9干旱诱导表达对柳枝稷光合作用和水分利用效率（WUE）的影响。结果证实，该诱导表达模式不仅在正常和干旱条件下均提升了植株的光合速率，还在干旱处理后显著提高了水分利用效率，表明PvHVA1pro可作为一种有效的调控工具应用于柳枝稷耐旱性研究中靶基因的诱导表达（Fig. 6）。

图6. PvHVA1pro::PIP2;9转基因柳枝稷的光合特性。 在对照和水分亏缺条件下测定顶部第三片叶子。(a) 气孔导度。(b) 光合速率。(c) 蒸腾速率。(d) 水分利用效率。数据代表平均值±SE (n = 3)。每列上方的不同字母表示平均值之间存在显著差异（p < 0.05）。