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EEB·4.7|南京农业大学杨志民教授团队揭示DNA去甲基化调控多年生黑麦草分蘖生长的表观遗传机制

2026-04-07 07:24:36

文献标题：DNA hypomethylation induced by drought preconditioning improved physiological responses and promoted tiller growth of perennial ryegrass

文献译名：干旱预处理诱导的 DNA 低甲基化改善多年生黑麦草的生理响应并促进其分蘖生长期刊名称：Environmental and Experimental Botany发表时间：2026 年 01 月 29 日影响因子：4.7通讯作者：杨志民教授通讯邮箱：nauyzm@njau.edu.cn项目基金：本研究由国家自然科学基金项目（32171689、32573612）资助。

研究背景

多年生黑麦草（Lolium perenne L.）是温带地区广泛栽培的优良牧草，其分蘖能力决定了枝条密度和整体生物量，并深刻影响植物对环境胁迫的适应性。作为一种对干旱敏感的草种，长期干旱会严重破坏多年生黑麦草的分蘖起始并降低分蘖活力。在全球气候变化背景下，提高其水分利用效率和分蘖能力成为关键挑战。干旱预处理（干旱引发）作为一种非遗传性的预适应策略，能够显著改善植物在后续干旱中的水分状况、光合作用及产量。先前的研究表明，经历干旱预处理的多年生黑麦草不仅维持了更高的叶片相对含水量和叶绿素含量，甚至产生了比持续水分充足条件下更多的分蘖和地上生物量，这与光合途径相关基因的富集密切相关。

尽管干旱预处理的表型益处已得到证实，但其促进多年生黑麦草生理响应和分蘖生长的潜在机制尚不明确。DNA甲基化作为调控基因表达的关键表观遗传修饰，在植物响应环境胁迫及形成干旱“记忆”中发挥着核心作用。研究表明，干旱胁迫会诱导全基因组DNA甲基化水平的改变，而外源施用甲基供体（如SAM）或去甲基化剂（如5-azaC）能够显著改变植物的生长发育轨迹。此外，特定的甲基化变化（如超甲基化）可通过抑制FLC和BFT等基因来调节植物的发育过程。然而，干旱胁迫对DNA甲基化模式的影响具有物种和组织特异性。目前关于干旱预处理的甲基化分析大多局限于单一或少数时间点，显著缺乏在整个干旱预处理周期中对DNA甲基化水平动态变化进行多时间点连续追踪的系统性研究。

为了揭示干旱预处理促进生长的表观遗传机制，本研究系统追踪了多年生黑麦草冠部在整个干旱预处理周期中DNA甲基化的时间动态，并通过外源施用SAM和5-azaC对DNA甲基化在调节生理反应和分蘖中的功能进行了药理学验证。此外，研究还深入剖析了关键DNA甲基转移酶和去甲基化酶基因的转录表达模式及其与生理参数的相关性。本研究验证了干旱预处理通过调控DNA甲基化水平促进生长的机制假设，揭示了干旱预处理诱导的DNA去甲基化是改善多年生黑麦草生长和抗逆性的关键机制基础，为在水资源受限条件下通过表观遗传调控提升牧草产量和耐旱性提供了重要的理论依据。

本研究揭示了干旱预处理通过诱导冠部全基因组DNA去甲基化，进而调控相关靶基因表达，从而显著改善多年生黑麦草在后续干旱胁迫下的光合生理响应并促进分蘖生长的表观遗传机制。

研究方法

2.1试验材料与干旱及药理学处理设计

为探究干旱预处理下DNA甲基化的时间动态及其调控分蘖生长的潜在机制，研究选用多年生黑麦草（‘Monterey Ⅲ’）作为试验材料，在人工气候室中进行盆栽试验。试验首先设置了充分浇水对照（WW）、干旱预处理（DP）以及干旱-复水（DR）三个处理组，旨在通过采集不同时间点的冠部组织来追踪全基因组DNA甲基化的动态变化。为进一步进行机制验证，试验引入了两种对DNA甲基化具有相反作用的化学物质。一方面，在干旱预处理的首次复水期间叶面喷施甲基供体SAM（DPS处理），以期抵消干旱预处理诱导的去甲基化效应；另一方面，在干旱胁迫前叶面喷施DNA甲基化抑制剂5-azaC（AD处理），以期模拟干旱预处理的促生长效应，并分别设立了相应的对照组进行严密的科学比对。

2.2 农艺表型与生理光合指标测定

为全面评估不同处理对植物生长和生理状态的影响，试验系统测定了多项农艺与生理生化指标。在农艺性状方面，定期统计植株的分蘖数，并在试验末期称量地上部的鲜重与干重以量化生物量积累。在水分状态与逆境生理方面，通过称重法监测土壤相对含水量（SRWC），并同步测定叶片相对含水量（LRWC）、叶绿素含量以及反映细胞膜损伤程度的电解质渗透率（EL）。此外，在关键的干旱及复水时间点，利用便携式光合仪精确量化了叶片的净光合速率、气孔导度、胞间CO₂浓度和蒸腾速率，并据此计算出水分利用效率和羧化效率，从而多维度解析植物在不同水分及药理学干预下的光合生理响应。

2.3 甲基化检测、基因表达分析与统计评估

为从分子层面揭示表型变化背后的表观遗传机制，试验提取了冠部基因组DNA，利用双酶切结合甲基化敏感扩增多态性（MSAP）技术，计算了不同处理下的总甲基化率、全甲基化率和半甲基化率。同时，提取冠部总RNA并逆转录为cDNA，以LpeIF4A（eukaryotic initiation factor 4 alpha）为内参基因，采用2⁻ΔΔCT法通过qRT-PCR技术精确定量了DNA甲基化及去甲基化相关靶基因的相对表达水平。最终，所有采集的数据均导入SPSS软件进行单因素方差分析（ANOVA）和Fisher最小显著性差异（LSD）检验（p < 0.05），并结合Pearson相关性分析深入探讨了基因表达水平与各项生理参数之间的内在统计学关联。

研究结果

3.1. 干旱预处理下全基因组DNA甲基化水平的动态变化

干旱期激增：经历14天首次干旱胁迫后，干旱预处理组和持续干旱组的DNA总甲基化率和全甲基化率均显著上升，而半甲基化率相应下降。
复水期回落：经过3天复水，干旱预处理组的全甲基化率降至对照水平，总甲基化率虽仍高于对照，但已显著低于持续干旱组。
后期趋稳定：在第二次干旱及复水结束后，干旱预处理组的各项甲基化指标持续下降，最终与充分浇水对照组无显著差异。

MSAP分析结果表明，多年生黑麦草在首次干旱胁迫下全基因组DNA总甲基化率和全甲基化率显著激增；然而，随着复水及后续干旱-复水周期的进行，干旱预处理组的甲基化水平逐渐回落，并在周期结束后稳定在与充分浇水对照组相似的基线水平，而持续干旱组则始终维持较高的甲基化状态。(Fig.1)

图1. 充分浇水对照(WW)、干旱预处理(DP)和干旱-复水(DR)处理下多年生黑麦草冠部DNA甲基化水平的动态变化。 (A) MSAP分析的代表性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。泳道1 H、2 H、3 H、4 H、5 H代表5种引物扩增并经Eco RI/Hpa II双酶切的DNA片段的MSAP结果。1 M、2 M、3 M、4 M、5 M代表5种引物扩增并经Eco RI/Msp I双酶切的DNA片段的MSAP结果。类型I、类型II和类型III条带分别表示无甲基化、半甲基化和全甲基化。(B) 总甲基化率；(C) 全甲基化率；(D) 半甲基化率。数据为平均值±标准误(n = 3)。柱状图上方不同的小写字母表示处理间差异显著(p < 0.05)。

3.2. SAM和5-azaC分别对干旱预处理和干旱胁迫下生理反应及分蘖发育的影响

3.2.1. 外源喷施SAM抵消了干旱预处理对分蘖发育的促进作用

生理受抑制：在复水期外源施用甲基供体SAM后，植物在后续干旱及复水期的叶绿素含量显著降低，电解质渗漏率增加，抵消了干旱预处理的生理优势。
光合受抑制：SAM处理显著抑制了干旱预处理带来的光合优势，导致植物的净光合速率、气孔导度、蒸腾速率以及水分利用效率大幅下降。
分蘖受抵消：SAM的施用有效消除了干旱预处理对分蘖生长的促进作用，使处理组植株的分蘖数量和地上部生物量降至与充分浇水对照组无统计学差异的水平。

为了验证DNA甲基化降低对分蘖发育的促进作用，试验在首次复水期外源喷施了甲基供体SAM。结果显示，SAM处理不仅显著削弱了干旱预处理在维持叶绿素含量和提升光合气体交换参数（如净光合速率和气孔导度）方面的生理优势，还完全抵消了干旱预处理对地上部生物量积累和分蘖数量增加的促进效应，使植物的生长状态退化至与未受预处理的充分浇水对照组相似。(Fig.2)(Fig.3)(Fig.4)

图2. 充分浇水对照(WW)、干旱预处理(DP)以及干旱预处理下喷施SAM(DPS)处理下多年生黑麦草的植物水分状况和生理指标。 (A) 土壤相对含水量(SRWC)。(B) 叶片相对含水量(LRWC)。(C) 电解质渗漏率(EL)。(D) 叶绿素含量(Chl)。数据代表三个重复的平均值。灰色阴影区域代表施用SAM的时期。垂直条表示同一天处理间比较的最小显著性差异(LSD)值(p < 0.05)。

图3. 充分浇水对照(WW)、干旱预处理(DP)以及干旱预处理下喷施SAM(DPS)处理下多年生黑麦草的光合气体交换参数。 光合气体交换属性包括在第26天和第29天记录的净光合速率(Pn)(A)、气孔导度(Gs)(B)、胞间CO₂浓度(Ci)(C)、蒸腾速率(Tr)(D)、胞间水分利用效率(WUE)(E)和羧化效率(CE)(F)。数据为平均值±标准误(n = 3)。给定日期柱状图上方不同的小写字母表示处理间差异显著(p < 0.05)。

图4. 充分浇水对照(WW)、干旱预处理(DP)以及干旱预处理下喷施SAM(DPS)处理下多年生黑麦草的生物量和分蘖数。 地上部鲜重(A)和干重(B)在第40天测量。(C) WW、DP和DPS处理下不同时间间隔的分蘖数。(D) 第40天WW、DP和DPS处理下多年生黑麦草的表型。数据为平均值±标准误(n = 3)。给定日期柱状图上方不同的小写字母表示处理间差异显著(p < 0.05)。

3.2.2. 5-azaC预处理可模拟干旱预处理对生理反应和分蘖发育的影响

生理获改善：在干旱胁迫前使用去甲基化剂5-azaC进行预处理，显著提高了植物在干旱下的叶片相对含水量，并有效降低了电解质渗漏率。
光合获提升：5-azaC预处理显著改善了干旱胁迫下的光合作用，提高了净光合速率、气孔导度、蒸腾速率、水分利用效率及羧化效率。
分蘖获促进：与单纯干旱处理相比，5-azaC预处理显著增加了干旱胁迫下植株的地上部鲜重和分蘖数量，有效缓解了干旱引起的叶片萎蔫症状。

为进一步探究低甲基化水平与分蘖增加的关联，试验采用去甲基化剂5-azaC模拟了干旱预处理效应。结果表明，5-azaC预处理成功模拟了干旱预处理的促生长作用，在干旱胁迫下显著改善了植物的水分状态和细胞膜稳定性，大幅提升了各项光合气体交换参数，并最终显著促进了地上部生物量的积累和分蘖数量的增加，有效增强了植物的耐旱表型。(Fig.5)(Fig.6)(Fig.7)

图5. 充分浇水对照(WW)、干旱处理(WD)、5-azaC预处理并充分浇水(AW)以及5-azaC预处理随后干旱处理(AD)下多年生黑麦草的植物水分状况和生理指标。 (A) 土壤相对含水量。(B) 叶片相对含水量。(C) 电解质渗漏率。(D) 叶绿素含量。数据代表三个重复的平均值。灰色阴影区域代表施用5-azaC的时期。垂直条表示同一天处理间比较的最小显著性差异(LSD)值(p < 0.05)。

图6. 充分浇水对照(WW)、干旱处理(WD)、5-azaC预处理并充分浇水(AW)以及5-azaC预处理随后干旱处理(AD)下多年生黑麦草的光合气体交换参数。 光合气体交换属性包括在第35天记录的净光合速率(Pn)(A)、气孔导度(Gs)(B)、胞间CO₂浓度(Ci)(C)、蒸腾速率(Tr)(D)、胞间水分利用效率(WUE)(E)和羧化效率(CE)(F)。数据为平均值±标准误(n = 3)。给定日期柱状图上方不同的小写字母表示处理间差异显著(p < 0.05)。

图7. 充分浇水对照(WW)、干旱处理(WD)、5-azaC预处理并充分浇水(AW)以及5-azaC预处理随后干旱处理(AD)下多年生黑麦草的生物量和分蘖数。 地上部生物量的鲜重(A)和干重(B)在第35天测量。(C) WW、WD、AW和AD处理下不同时间点单株分蘖数。(D) 第35天WW、WD、AW和AD处理下多年生黑麦草的照片。数据为平均值±标准误(n = 3)。给定日期柱状图上方不同的小写字母表示处理间差异显著(p < 0.05)。

3.3. SAM和5-azaC对DNA甲基化和去甲基化相关基因表达的影响及其与生理指标的相关性

表达受调控：SAM处理显著上调了DNA甲基化建立与维持基因的表达并下调了去甲基化基因；而5-azaC处理则产生相反效果，显著促进了去甲基化基因的表达。
生理强相关：相关性分析显示，DNA甲基化维持基因的表达与叶片含水量、光合参数呈显著负相关，而DNA去甲基化基因则与这些促进生长的生理指标呈显著正相关。

基因表达及相关性分析进一步揭示了表观遗传调控机制。SAM和5-azaC处理分别从正反两方面显著改变了冠部DNA甲基化建立、维持（如LpDRM2、LpMET1）及去甲基化（如LpROS1、LpDME）相关靶基因的转录水平。更为关键的是，DNA甲基化维持基因的表达量与叶片相对含水量、叶绿素含量及各项光合参数呈显著负相关，而DNA去甲基化基因的表达则与这些生理指标呈显著正相关，充分证明了DNA甲基化动态在调控植物生理响应和分蘖发育中的核心作用。(Fig.8)

图8. 多年生黑麦草不同处理下DNA甲基化相关基因相对表达水平的热图及其与生理性状的相关性。 (A) 10 µM SAM对多年生黑麦草干旱预处理下参与DNA甲基化基因转录水平的影响。(B) 50 µM 5-azaC对多年生黑麦草干旱胁迫下参与DNA甲基化基因转录水平的影响。(C) 计算的多年生黑麦草DNA甲基化相关基因表达水平与生理参数的皮尔逊相关系数。在(A)中，分别分析了干旱预处理(DP)和干旱预处理下喷施SAM(DPS)与充分浇水对照(WW)相比的显著性，并分析了DP和DPS之间的显著性。在(B)中，分别分析了5-azaC预处理并充分浇水(AW)、干旱处理(WD)和5-azaC预处理随后干旱处理(AD)与充分浇水对照(WW)相比的显著性，并分析了WD和AD之间的显著性。在(C)中，红色表示正相关，蓝色表示负相关。表示两个处理之间存在显著差异。显著性水平：p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001。

研究创新性

1. 首次系统追踪干旱预处理全周期的DNA甲基化时间动态。以往关于植物干旱“记忆”的甲基化研究通常局限于单一或极少数的时间点，缺乏连续性。本研究打破了这一局限，创新性地利用MSAP技术，针对多年生黑麦草负责分蘖产生和胁迫后恢复的核心组织（冠部），在整个干旱预处理周期（首次干旱-首次复水-二次干旱-二次复水）的多个关键时间点，全面、连续地追踪了全基因组DNA甲基化水平的动态变化特征，填补了该领域在时间维度上的研究空白。
2. 创新性引入正反双向的药理学试验进行因果机制验证。本研究没有停留在表观遗传修饰与表型变化的简单相关性分析上，而是巧妙地引入了两种对DNA甲基化具有截然相反作用的化学物质进行功能性验证。通过外源施用甲基供体（SAM）来“抵消”预处理带来的去甲基化效应，以及施用DNA甲基化抑制剂（5-azaC）来“模拟”预处理的去甲基化效应。这种正反双向的药理学干预设计，强有力地证实了“DNA去甲基化”与“干旱预处理促进分蘖生长及生理改善”之间的直接因果关系。
3. 深度解析表观遗传靶基因表达与宏观生理表型的内在关联。研究不仅在全基因组水平上评估了甲基化状态，还深入到转录水平，精确定量了冠部组织中DNA甲基化建立、维持（如LpDRM2、LpMET1）以及主动去甲基化（如LpROS1、LpDME）关键靶基因的表达模式。同时，创新性地将这些微观的分子表达数据与宏观的植物水分状况、光合气体交换参数、细胞膜稳定性及分蘖数等农艺生理指标进行了系统的Pearson相关性分析，构建了从“基因表达调控”到“生理表型响应”的完整逻辑链条。
4. 揭示了多年生牧草抗逆与促生协同的表观遗传新机制。长期干旱通常会抑制植物分蘖，而干旱预处理却能反常地促进多年生黑麦草的分蘖生长，其潜在机制一直是个谜。本研究明确提出了“干旱预处理诱导的DNA去甲基化是改善多年生黑麦草生理反应并促进分蘖生长的关键机制基础”这一全新科学结论。这不仅深化了对植物非遗传性干旱适应（干旱记忆）机制的理解，也为在全球气候变化和水资源受限背景下，通过表观遗传途径培育高产、耐旱的优良牧草提供了重要的理论依据和新思路。