（一）HvTrh的序列特征与时空表达模式
HvTrh 具有典型的bHLH-PAS结构域，且在鞘翅目昆虫中高度保守。表达分析显示，HvTrh 在蛹期的表达量最高，且在幼虫中肠中的表达显著高于表皮、脂肪体和马氏管。
（二）沉默HvTrh导致致命的蜕皮缺陷
实验通过对1-4龄幼虫注射dsRNA干扰 HvTrh 的表达。结果显示：
高致死率：1-4龄幼虫的死亡率分别高达 70%、70%、100% 和 90% 。
表型特征：1龄幼虫发育停止并死亡；2龄和3龄幼虫表现为蜕皮启动但无法脱去旧表皮，常出现刺分叉倒伏和体节粘连现象；4龄幼虫则无法完成化蛹过程 。
呼吸系统正常：尽管 Trh 在胚胎期负责气管发育，但幼虫期敲降 HvTrh 后，其气管形态和螺旋丝结构保持正常，说明其致死并非由呼吸受阻引起。
图 1. 沉默 HvTrh 对不同幼虫龄期的影响。(A–M)：1至4龄幼虫注射 dsHvTrh 后产生的表型变化。(N–Q)：1至4龄幼虫的存活率曲线 。
（三）HvTrh通过20E信号通路调控蜕皮
基因下调：沉默 HvTrh 后，20E合成基因 (Hvshd, Hvphm, Hvsad) 和信号基因 (HvEcR, HvUSP, HvE75) 显著下调，而 HvHR3 表达上调。
滴度下降：4龄幼虫血淋巴中的20E滴度明显降低。
不可挽救性：外源补充20E无法挽救 HvTrh 沉默导致的死亡或蜕皮失败，表明组织对20E信号的解读能力受损。
图 3. 沉默 HvTrh 对 20E 通路的影响。(A)：20E 相关基因的表达水平。基因缩写说明：shd (shade)、phm (Phantom)、sad (shadow)、EcR (蜕皮激素受体)、USP (Ultraspiracle)、E75 (蜕皮激素诱导蛋白 75)、HR3 (激素受体 3)。(B)：4龄幼虫体内的 20E 滴度。(C)：外源补充 20E 后的 RNAi 效率（Rescue实验结果）。
（四）HvTrh对表皮重塑的影响
组织学观察发现，控制组幼虫经历了正常的表皮离层和新表皮沉积，而 HvTrh 敲降组完全未能脱去旧表皮，且新表皮合成失败。此外，壳多糖合成酶基因 HvCHS1 显著下调，且壳多糖沉积大幅减少。
图 4. 沉默 HvTrh 对4龄幼虫蜕皮的影响。(A)：壳多糖合成酶 1 (HvCHS1) 的表达水平。(B–C)：dsGFP 处理组（对照组）与 dsHvTrh 处理组4龄幼虫腹部表皮的 HE 染色观察。蓝色箭头表示新形成的表皮，EC 代表表皮细胞。(D–E)：dsGFP 处理组与 dsHvTrh 处理组表皮的荧光增白剂 28 (FB28) 染色结果，用于观察壳多糖沉积。
（四）分子机制：HvTrh直接激活HvE75
通过双荧光素酶报告基因实验 (DLR) 和凝胶迁移实验 (EMSA) 证实：
HvTrh 能显著增强 HvE75 的启动子活性 。
HvTrh 蛋白通过结合 HvE75 启动子区域的一个特定 CME (ACGTG) 基序来实现转录激活作用。
图 5. HvE75 启动子中 CME 位点的功能分析。(A)：克隆的 2000-bp HvE75 启动子示意图，标示了两个推测的中枢神经系统中线元件 (CME) 位点（红色框）。(B)：使用包含野生型 (HvE75-WT) 或突变型 (HvE75-MT) 的短启动子片段（约 200 bp）进行双荧光素酶报告基因 (DLR) 检测。HEK293T 细胞共转染野生型或突变型构建体，以及 HvTrh 表达质粒 (pcDNA3.1-HvTrh) 或空载体对照 (pcDNA3.1-Basic)，并以 pRL-TK 质粒作为内参照。(C)：电泳迁移实验 (EMSA) 显示 HvTrh 蛋白与 HvE75 探针的结合。实验条件包括：生物素标记的 HvE75-WT 和突变型 (HvE75-MT) 探针与重组 HvTrh 蛋白孵育；竞争实验中使用递增浓度（10倍、50倍、100倍摩尔过量）的未标记 HvE75-WT 探针。
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