PBJ | 中国农业大学陈其军团队开发基于Csy4 CRISPR核酸内切酶的两种高效引导编辑系统

研究背景

引导编辑（Prime Editing, PE）作为一种先进的CRISPR/Cas衍生技术，能够在基因组的特定位点实现精准的碱基替换、插入和删除，且无需产生DNA双链断裂（DSB）或依赖供体DNA模板。然而，传统的未拆分PE系统（Unsplit PE）蛋白分子量巨大，给基于病毒载体等受限于装载容量的递送系统带来了挑战。

为了解决这一问题，科学家们开发了多种拆分型PE（Split PE, sPE）策略，如利用split inteins（内含肽）、MS2适配体、SunTag系统、CC-PE以及非拴系的逆转录酶（Untethered RT）等。这些策略将庞大的PE复合物拆分为两个较小的部分分别表达，在细胞内重新组装或协同作用，从而提高了递送的灵活性。然而，现有的拆分策略往往需要多个独立的步骤来招募逆转录酶（RT）到靶位点，或者需要复杂的反式剪接过程。

Csy4（也称为Cas6f）是CRISPR I-F亚型系统中负责加工crRNA的关键酶。Csy4的一个显著特性是，它在识别并切割Csy4识别序列（Csy4RS）后，仍能与切割产物（crRNA）保持高亲和力的紧密结合。此前，Csy4系统已被用于PE系统中的pegRNA加工。基于Csy4的这种特性，研究人员假设：如果利用Csy4与Csy4RS的强结合力，能否构建一种新型的拆分PE系统，将RNA加工、RNA保护以及RT招募这三个功能合而为一？

论文概要

中国农业大学生物学院植物抗逆高效全国重点实验室的陈其军教授团队在植物生物技术权威期刊 Plant Biotechnology Journal 发表了题为“Two Highly Efficient Prime Editing Systems Based on the Csy4 CRISPR Endonuclease”的研究论文。该研究创新性地开发了基于Csy4核酸内切酶的新型引导编辑系统。

研究团队设计了基于Csy4的拆分型PE（sPE）和未拆分型PE（Unsplit PE）。在拆分型系统中，通过将逆转录酶（RT）与Csy4融合，利用Csy4与pegRNA上特定序列的结合，成功将RT招募至Cas9切口酶处，实现了高效编辑。在水稻中的广泛测试表明，这些基于Csy4的PE系统显著优于传统的未拆分PE对照和非拴系RT的拆分PE对照。特别是去除evopreQ1结构的优化版本，进一步提升了编辑效率，为植物基因组编辑和基因治疗提供了一种强有力的新工具。

主要研究结果

1. 基于Csy4的新型引导编辑系统设计策略（图1a, 1b）

为了验证利用Csy4系统开发新型PE的可行性，研究团队设计了一系列精巧的分子构建体：

• 设计原理：Csy4酶能特异性识别并切割pegRNA转录本上的Csy4RS序列。切割后，Csy4蛋白不会脱落，而是紧紧结合在形成的epegRNA-Csy4RS复合物上。如果将逆转录酶（RT）与Csy4蛋白融合（Csy4-RT），那么Csy4就能像一个“抓手”，抓住pegRNA，同时将RT带到由SpCas9n（H840A切口酶）定位的基因组靶点处，从而驱动引导编辑过程。
• 拆分型PE（sPE）构建：基于上述原理，研究人员构建了两种新型拆分PE：
• 9s42：由Cas9n和Csy4-RT2组成。
• 9s24：由Cas9n和RT2-Csy4组成。
• 对照组包括非拴系RT的拆分PE（9s2）。
• 融合型/未拆分PE（Unsplit PE）构建：为了测试Csy4融合蛋白的活性，研究人员还构建了Csy4与PEmax的融合蛋白：
• 492：Csy4-PEmax（不可切割融合）。
• 924：PEmax-Csy4（不可切割融合）。
• 4A92：Csy4-P2A-PEmax（中间通过P2A自剪切肽连接，表达后Csy4和PEmax分离）。
• 对照组为标准的PEmax（92）。
• RNA表达系统：对于基于Csy4的系统，研究人员设计了含有20bp Csy4RS序列的RNA表达盒（2×PE3RS），使得pegRNA和sgRNA的两端都带有Csy4识别位点，便于加工和结合。

2. Csy4基PE系统在水稻中表现出卓越的编辑效率（图1c, 1d）

研究团队在转基因水稻中选取了11到15个基因的12或16个靶点进行测试，全面比较了上述8种PE系统的编辑效率。

• 整体优势：结果显示，所有6种基于Csy4的PE系统（包括拆分型和未拆分型），其总体编辑效率均大幅优于传统的未拆分PE对照（92V1）和非拴系RT的拆分PE对照（9s2V1）。
• 拆分型系统的成功：基于Csy4的拆分PE（9s42和9s24）表现优异。这归功于Csy4系统独特的“一石三鸟”机制：它将pegRNA的加工、3'末端的保护以及RT的招募这三个步骤整合到了一个简化的过程中，消除了对额外RT招募步骤的需求（相比之下，Intein、MS2等系统需要独立的步骤）。
• 未拆分系统的发现：研究发现，不可切割的融合蛋白Csy4-PEmax（492）的编辑效率高于可切割的Csy4-P2A-PEmax（4A92）。这可能是因为直接融合的Csy4能更有效地将pegRNA招募到PEmax蛋白附近，增加了局部浓度和反应几率。

3. 去除evopreQ1结构进一步提升效率

在之前的PE优化研究中（如ePE系统），研究人员通常在pegRNA的3'末端添加evopreQ1（一种RNA结构基序）来防止核酸外切酶的降解。 在本研究中，团队假设：既然Csy4蛋白能紧密结合在pegRNA的3'末端，它本身就能提供足够的物理保护，防止RNA降解，因此可能不再需要庞大的evopreQ1结构。

• 实验验证：研究人员构建了去除evopreQ1的RNA表达盒（2×PE3RS∆E），并与含evopreQ1的系统进行对比。
• 结果：去除evopreQ1后，Csy4基PE系统的编辑效率进一步提升（4A92∆E对比4A92提高了1.8倍）。
• 机制解释：Csy4-pegRNA复合物不仅提供了足够的稳定性保护，而且去除evopreQ1可能减少了该结构引起的空间位阻，或者减少了spacer（间隔序列）与PBS（引物结合位点）之间不必要的杂交干扰。这表明，Csy4结合机制在稳定pegRNA方面比evopreQ1 RNA基序更具优势，且能与RNA结合蛋白辅助的策略（如PE7系统）相媲美甚至更优。

全文总结与展望

本研究成功开发了一套基于Csy4 CRISPR核酸内切酶的高效引导编辑工具箱。

核心结论如下：

1. 首创Csy4拆分PE：利用Csy4与RNA产物的高亲和力，开发了新型拆分PE（SpCas9KK-H840A + Csy4-RT）。该系统将pegRNA加工、保护和RT招募耦合在一起，极大简化了反应步骤，在水稻中实现了比传统拆分PE更高的效率。
2. 优化未拆分PE：证明了不可切割的Csy4-PEmax融合蛋白比可切割版本（P2A连接）具有更高的活性，为PE蛋白的改造提供了新思路。
3. 简化RNA设计：证实了在Csy4系统的保护下，pegRNA不再需要evopreQ1等复杂的末端稳定结构，从而简化了pegRNA的设计并提升了效率。
4. 安全性：与早期部分报道不同，本研究在水稻中未观察到明显的Csy4介导的细胞毒性，证明了该系统的安全性。

展望：这项工作不仅丰富了植物基因组编辑的工具库，也为克服PE系统递送难题提供了强有力的解决方案。基于Csy4的拆分PE系统因其紧凑的结构和高效的机制，特别适合应用于病毒载体递送，在农业生物育种和未来的基因治疗领域具有广阔的应用前景。此外，该系统展示的“蛋白-RNA互作辅助编辑”的理念，也为基于其他CRISPR/Cas系统和逆转录酶开发新型PE提供了通用平台。

研究团队与资助

该论文的第一作者为中国农业大学生物学院的博士研究生Yu Lu、Dexin  Qiao和Junya Wang（共同第一作者）。通讯作者为中国农业大学陈其军教授。研究工作得到了国家重点研发计划（2023YFD1202905）和生物育种重大项目（2023ZD0407403）的资助。

DOI链接

https://doi.org/10.1111/pbi.70337