（一）体表化合物的动态变化规律
研究团队通过 GC-MS 分析了云杉花墨天牛雌虫在 5 个发育阶段（性未成熟、性成熟及交配后 0 h、24 h、48 h）的体表化合物。实验共鉴定出 21 种共享成分，主要由正烷烃、烯烃和甲基支链烷烃组成，其中长链化合物 (C ≥ 16) 占绝大多数。二十五烷 (C25H25) 是含量最丰富的成分，在性未成熟期含量较低，但在成熟后显著增加，并在交配后表现出明显的波动规律。
图 1. 云杉花墨天牛雌成虫 21 种体表化合物的趋势分析。 (A) 五个发育阶段（阶段 A–E）的趋势分析。(B) 三个交配后阶段（阶段 C–E）的趋势分析 。
（二）代谢组学揭示脂肪酸代谢的核心地位
利用 LC-MS 技术在雌虫样本中鉴定出 17,584 种代谢物，其中羧酸及其衍生物占比最高（16.16%）。通过趋势分析和加权基因共表达网络分析 (WGCNA)，研究人员锁定了 blue2 等关键模块，KEGG 富集分析显示这些模块高度富集在脂肪酸合成通路。此外，十六烷酸被鉴定为含量最高且具有关键前体作用的代谢物。
图 2. 云杉花墨天牛五个不同发育阶段的代谢物类别组成情况。
图 6. 信息素合成过程中云杉花墨天牛的加权基因共表达网络分析（WGCNA）。(A) 通过 WGCNA 鉴定的聚类树状图及模块。(B) WGCNA 模块与表型特征之间的关联热图 。黄色表示代谢物水平较高，蓝色表示代谢物水平较低 。右侧比例尺显示了从最低（蓝色）到最高（黄色）浓度的数值范围。
图 7. 经 WGCNA 筛选的关键板块分析。 (A) blue2、brown4、lightpink3、skyblue1 模块的代谢物表达模式。(B) 与三个模型相关的 KEGG 富集结果中的代谢物表达模式 。
图 8. 脂肪酸代谢通路对云杉花墨天牛雌虫信息素合成的调控。(A) 关键代谢物之间的相关性热图。面积越大、颜色越深表示相关性越强。(B) 关键代谢物间的相关性网络。黄色圆圈代表代谢物，圆圈大小对应平均丰度 。红线表示相关系数 cor > 0，蓝线表示 cor < 0，线条粗细对应相关系数的绝对值 |cor|。
（三）转录组筛选关键合成基因
通过对表皮组织进行转录组测序，研究团队筛选出 72 个与信息素合成相关的候选基因，涵盖了 FAS、ELO、FAR 等 13 个类别。GO 和 KEGG 分析进一步验证了脂肪酸代谢和不饱和脂肪酸生物合成在其中的主导地位。蛋白互作网络 (PPI) 分析显示，MsalELO5 处于核心调控节点，具有极高的连通性。
图 9. 差异表达基因（DEGs）的功能富集。(A) DEGs 的 GO 富集圈图。(B) DEGs 的 KEGG 通路富集圈图。(C) DEGs 富集的前 20 个 GO 条目分析。(D) 前 20 个 KEGG 富集通路分析。在气泡图中，y 轴代表 -log10(Q值)，x 轴代表 z-score 值。
图 10. 云杉花墨天牛信息素生物合成相关的 DEGs。 (A) 两个阶段参与信息素合成的 DEGs 表达谱。
（四）MsalELO5 的功能验证与行为响应
时空表达谱：RT-qPCR 结果显示 MsalELO5 在内生殖系统和表皮中表达量显著较高，且其表达趋势与体表化合物含量的动态变化高度一致。
RNAi 与行为测定：通过双链 RNA 干扰沉默 MsalELO5 后，雌虫体表的 9 种长链化合物水平显著下降。同时，雄虫对沉默组雌虫提取物的电生理 (EAG) 反应显著减弱，且交配成功率由对照组的平均 12.83 次下降至 6.5 次。
图 13. MsalELO5 的 qRT-PCR 表达谱分析。 (A) 成虫不同组织中 MsalELO5 表达的相对定量 。TA：触角；TH：头；TE：鞘翅；TB：前胸；TL：足；TI：内生殖系统；TG：肠道；TX：血淋巴；TC：表皮。(B) 雌成虫不同发育阶段 MsalELO5 表达的相对定量。FA：未成熟；FB：成熟；FC：交配后 0 h；FD：交配后 24 h；FE：交配后 48 h 。相对表达水平以平均值 ± 标准误（SEM）表示 。柱状图上方不同的字母表示显著差异（p < 0.05，单因素方差分析后进行 Tukey's HSD 检验）。
图 14. 干扰 MsalELO5 对信息素合成的影响。 (A) 使用 qPCR 检测注射 dsRNA 后不同时间点靶基因的表达变化 。(B) RNAi 后云杉花墨天牛的交配成功率，包括雌虫（n = 180）和雄虫（n = 180）。(C) 对 RNAi 处理组雌虫信息素提取物的触角电位（EAG）响应。(D) 干扰后 21 种体表化合物的变化。化合物编号 1–21 与表 1 之前的物质列表相对应 。显著性分析采用单因素方差分析中的 Tukey's HSD 检验（P < 0.05）。
