当前位置：首页>农业>当期论文 | 吉林农业大学吴秋霖,李雪莹等:花生AhFAB2-2生物信息学分析、克隆及过表达载体的构建

当期论文 | 吉林农业大学吴秋霖,李雪莹等:花生AhFAB2-2生物信息学分析、克隆及过表达载体的构建

2026-02-10 19:45:58

作者及单位

吴秋霖¹，张君^1，2，韩笑¹，丛炜轩¹，杨松楠¹，姚丹³，朱静静¹，李雪莹^1*

1. 吉林农业大学农学院，长春 130118； 2. 吉林农业大学国家农作物品种审定特性鉴定站，长春103118； 3. 吉林农业大学生命科学学院，长春 130118

基金信息

吉林省科技发展计划项目（20230202008NC，20220202003NC），吉林省教育厅科学技术研究项目（JJKH20230401CY）

摘要&关键词

摘要：以吉林农业大学选育的花生品种“吉农花7号”“吉农花8号”和“花育668”为试验材料，对编码硬脂酰-ACP脱饱和酶的SAD基因家族中的亚型AhFAB2-2进行生物信息学分析与克隆，并进行pCAMBIA3301-FAB2-2过表达载体的构建。结果显示：AhFAB2-2位于栽培种花生16号染色体上，主要在花生籽粒中表达；其编码的蛋白属于不稳定疏水非泌性蛋白；与其他物种已验证功能的SAD基因亚型编码的蛋白存在多个相同保守结构域；蛋白互作预测发现，与其互作蛋白负责调控细胞氮化合物生物合成、DNA模板转录的启动及高分子生物合成；荧光定量PCR结果显示，其在高油酸品种中的表达量高于低油酸品种，同时在低油酸品种中表达量随着籽粒成熟而逐渐升高，高油酸品种中表达量则随着籽粒成熟而降低。启动子元件预测分析发现，AhFAB2-2启动子存在光响应、激素调控、抗逆境相关转录因子结合位点。该结果可为后续深入研究AhFAB2-2对于花生油酸含量的调控与油料组成成分的改良提供理论基础。

关键词：花生；硬脂酰-ACP脱饱和酶；生物信息学分析；基因克隆；过表达载体构建

精要导读

花生（Arachis hypogaea L.）原名落花生，豆科落花生属一年生草本植物，是世界上重要的油料作物之一，被广泛种植于热带和亚热带地区。全球花生年产量>4 000万t，可稳定提供丰富的蛋白质、脂肪酸、维生素、矿物质和纤维等天然营养成分。每年共有近1 100万t花生被用于提取食用油。在世界食用油籽总产量中占比约为8%，在中国占比约为30%。在其油料组分中，不饱和脂肪酸约占总脂肪的80%，其中油酸含量占比在34%~46%。由于油酸比亚油酸少1个双键，因此油酸含量高的花生比亚油酸含量高的花生具有更好的氧化稳定性，因而不易氧化和腐败，具有更长的保质期且风味更好。对人体而言，油酸可以降低血液中的胆固醇和甘油三酯含量，进而降低血液黏稠度；还可以提高大脑细胞活性，进而增强记忆力，因此培育高油酸花生具有积极意义。

植物油脂的主要成分是三酰甘油（Triacylglycerol， TAG），主要在种子、果实中积累^［1］。种子油脂合成通常开始于胚形成末期，涉及的反应包括碳水化合物代谢和脂肪酸、三酰甘油以及油体的合成。种子发育过程中最初的物质以碳水化合物和含氮化合物的形态存在，这些物质会在种子发育过程中逐步转化为油脂^［2］。

脂肪酸的合成从质体中开始。质体中的乙酰辅酶A（Acetyl‑coenzyme， ACCase）作为脂肪酸从头合成的最初底物，在 ACCase酶催化作用下生成丙二酰辅酶A，然后，在脂肪酸合成酶（Fatty acid synthase， FAS）复合物的多循环作用下，依次缩合2个碳单元进行脂肪酸的从头合成。经7次循环后生成硬脂酰-ACP（C16：0-ACP）^［3-5］。硬脂酰-ACPΔ9脱氢酶（Stearoyl‑acyl carrier protein Δ9 desaturase， SAD）会催化硬脂酰-ACP 脱饱和，在脂肪酸链的C9和C10之间引入1个双键，形成油酰-ACP，将C18：0-ACP催化形成C18：1-ACP，是调控不饱和脂肪酸合成代谢的关键酶。前人研究表明，在花生中AhFAB2-2基因属于AhSAD基因家族的1个亚型^［6］，其在种子中特异性表达，且其表达量随着种子发育呈先上升后降低的趋势^［7］。另有研究表明，其表达量在植株油酸含量>60%时，该基因整体表达水平会受到抑制^［8］。

本研究通过对AhFAB2-2基因进行生物信息学分析、克隆及过表达载体构建，为后续花生油酸含量遗传改良研究提供前期基础。

结果与分析

AhFAB2-2的克隆与表达量分析

从“吉农花8号”花生胚芽中提取总RNA，以逆转录得到的cDNA为模板，进行目的基因全长扩增，扩增产物电泳结果显示，在1 387 bp处出现条带（图1），与预期大小一致。将目的基因条带进行胶回收，纯化并送生物公司进行测序，将结果与NCBI数据库中的原始序列进行比对，发现二者完全相同（图1），表明扩增得到了可用于后续试验的序列，该基因位于四倍体栽培花生A16染色体139 879 398~139 881 703 bp位置。根据数据库（peanutgr.fafu.edu.cn）内容整理后发现，在栽培种花生中13个SAD基因亚型中，AhFAB2-2在果皮、胚和种皮中的表达量均最高；表明AhFAB2-2在栽培花生中主要在上述3个部位表达（表1）。另外，在A6染色体上的同源基因AhSAD6A（基因ID： XM_025750554.1）表达量也很高，但根据已有研究，在种子发育过程中，基因表达明显偏向于位于A16染色体上的AhFAB2-2［6］，因此本试验不对其继续研究。

取低油酸品种“吉农花7号”和高油酸品种“花育668”为材料，选取粒径为3 mm和5 mm的籽粒进行荧光定量PCR分析。试验结果显示：AhFAB2-2在低油酸品种籽粒中，表达量随着其成熟而上升，上升幅度为57.19%；在高油酸品种籽粒中的表达量随着其成熟而下降，下降幅度为68.86%（图1）。该结果符合前人研究结果，即花生植株油酸含量>60%时，会抑制AhFAB2-2的表达^［8］。从总体上看，低油酸品种的表达量始终低于高油酸品种。

编码蛋白的理化性质分析与结构

域预测

通过NCBI中Conserved Domain查询后分析发现，AhFAB2-2编码蛋白有1个完整的类铁蛋白家族的保守结构域。该家族蛋白主要负责催化生物体二铁中心内的双氧依赖性氧化-羧基化反应，家族成员包括细菌铁蛋白、红霉素羟化酶、芳香族和烯烃单加氧酶、核糖核苷酸还原酶R2、酰基-ACP-去饱和酶、锰过氧化氢酶、脱甲基泛醌羟化酶、DNA保护蛋白和泛醇氧化酶，以及需氧化酶系统等。对氨基酸进行理化性质分析，预测其分子式为C₁₉₄₄H₃₀₄₀N₅₃₀O₅₇₅S₂₀，相对分子质量为43 677.93，等电点为5.69，不稳定系数为40.86，属于不稳定蛋白。

在线软件（SignalP 5.0）分析显示，AhFAB2-2编码疏水蛋白，无信号肽，属于非泌性蛋白；无跨膜结构域，属于非跨膜蛋白。利用SOPMA软件分析AhFAB2-2基因编码的氨基酸序列的二级结构，推测其是1个以α-螺旋（占比55.32%）和无规则卷曲（占比30.91%）为主体构成的结构（图2-A，蓝色为α-螺旋，绿色为β-转角，红色为延伸主链，紫色为随机卷曲）。利用SWISS-MODEL在线预测AhFAB2-2编码蛋白的三级结构，结果显示该蛋白呈紧密的球状结构（图2-B）。

AhFAB2-2系统进化树的构建及

编码蛋白的同源比对

将AhFAB2-2基因编码的氨基酸序列在NCBI中进行比对，发现其与鹰嘴豆、密花豆、大豆、蒺藜苜蓿、豌豆、白羽扇豆、红车轴草、黄羽扇豆、刺毛黧豆等物种的SAD基因亚型编码氨基酸序列同源性较高（>80%）。进化树分析显示，AhFAB2-2基因编码的蛋白与黄羽扇豆和白羽扇豆的SAD基因亚型编码的蛋白亲缘关系最近（图3-A）。而在栽培种花生中，AhFAB2-2编码的蛋白XP_025659112.2与位于6号染色体上的AhSAD6A基因编码的蛋白XP_025606339.1相似度最高（图3-B），经双序列比对得知相似度为88.71%（图3-C），利用DNAMAN进行多氨基酸序列比对，进一步证实了AhFAB2-2基因编码蛋白与比对序列拥有多个相同保守结构域（图4）。

蛋白互作预测

通过在线网站String并配合NCBI数据库查询，发现在与AhFAB2-2的互作蛋白中有4个蛋白参与了共表达（表2），GO注释表明互作的蛋白在生物功能层面主要负责调控细胞氮化合物生物合成、DNA模板转录的启动及高分子生物合成，在分子功能层面负责调控DNA结合及RNA聚合酶Ⅱ的一般转录起始因子的活性。这表明AhFAB2-2在以上2个层面中均可能发挥一定作用。

启动子元件分析

通过NCBI数据库查询并下载AhFAB2-2基因前2 000 bp启动子序列，利用在线网站PlantCare进行启动子元件分析，共发现35种元件，有功能的调控元件18种（表3）。按功能划分，最多的为光响应元件，其次是激素响应元件，包括茉莉酸甲酯、水杨酸、脱落酸响应元件，然后是生化反应元件，主要是厌氧诱导元件以及MYB转录因子的结合位点。这些元件的存在表明光照和逆境相关的非生物因素可能会对AhFAB2-2的表达产生影响。

AhFAB2-2过表达载体构建

用无缝克隆试剂盒进行过表达载体构建，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中后，进行菌液PCR验证，琼脂糖凝胶电泳显示目的条带在1 387 bp位置。经双酶切后琼脂糖凝胶电泳显示条带分别在10 657 bp和1 387 bp位置（图5-A）。将菌液提取质粒送测序，确定得到重组载体，将其命名为Pcambia3301-FAB2-2过表达重组载体（图5-B）。

讨论

SAD是1种存在于质体基质中的可溶性脂肪酸脱氢酶，通过在脂肪酸链的C9和C10之间插入1个双键，催化硬脂酰-ACP脱饱和生成油酰-ACP，从上游决定植物油脂中饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的比例。

前人研究表明，在花生中AhFAB2-2是AhSAD基因家族中的1个亚型^［6］。目前，研究人员在大豆^［10］、甘蓝型油菜^［11］、烟草^［12］、棉花^［13］、芝麻^［14］、菠菜^［15］、千年桐^［16］、拟南芥^［17］、椰子^［18］等多种植物中均成功克隆到SAD基因的不同亚型。研究表明，SAD基因在中高等植物中多呈现组织特异性表达，其在发育的种子中表达量高于其他组织，且表达量随着种子发育呈先升高后降低趋势^［17-26］。利用RNA干扰技术沉默棉花的SAD基因，硬脂酸含量由正常的2%~3%上升到约40%，与此同时棉籽油中其他3 种主要脂肪酸（棕榈酸、油酸和亚油酸）的含量也随之降低^［27］。拟南芥SAD基因突变导致硬脂酸含量从野生型的0.8%增加到14.3%，棕榈酸及油酸含量也随之减少^［28］，而过表达SAD6则使拟南芥油酸含量升高，硬脂酸含量降低，重新干扰SAD6 后，油料组分又可恢复至与野生型相同的水平^［29］。研究人员将马铃薯SAD基因转入烟草后，同样提高了叶片和种子中不饱和脂肪酸含量，并改变了脂肪酸组成^［12］。

本研究中AhFAB2-2编码的蛋白质无跨膜结构且属于非泌性蛋白，可知其主要在细胞质内发挥作用。而且与其他物种中SAD基因亚型存在多个保守结构域，推测AhFAB2-2可能与其他已经过验证可以调控油酸含量的SAD基因亚型具有同样的调控油酸合成的功能。

系统发育分析与数据库资料分析发现，花生SAD基因中存在与AhFAB2-2相似度很高，且表达量和表达位置分配相似的基因，即AhSAD6A。经前人研究表明，该基因位于A6染色体的A基因组。二者虽都在发育种子中表达，但在开花后30，40，70 d时，种子对于AhFAB2-2的表达偏向性显著高于开花后20，50，60 d。以开花后40 d为例，种子中克隆得到的23个SAD基因中，有16个是AhFAB2-2，7个是AhSAD6A；而同一时期的茎中克隆得到的23个SAD基因中，有15个是AhSAD6A，仅有8个是AhFAB2-2^［6］。这意味着二者在种子发育时处于交替优先表达的状态，符合数据库中AhSAD6A在同一发育时期不同组织中表达量与AhFAB2-2相近的结果，但也表明在发育的种子中AhFAB2-2的表达仍占据主导地位。由于花生是地上开花，地下结果，种子在发育过程中不受光照直接影响，但在AhFAB2-2启动子元件中发现存在大量光响应元件，因此推测光响应元件主要通过地上部分的茎秆和叶片来调控AhFAB2-2的表达，但具体调控机制仍有待探索^［8］。

AhFAB2-2基因启动子中存在MYB转录因子的结合位点，说明其在植株的抗逆胁迫过程中可能也发挥了一定的作用。MYB作为植物体内最大的转录因子家族之一，在植物抗逆胁迫过程中起着重要作用：在生物胁迫方面，如病原菌、虫害等；非生物胁迫方面，如伤害、干旱、寒冷、低氧和辐射等均观察到有MYB转录因子的调控^［30］。

油酸在FAD2的作用下向亚油酸转化，而亚油酸在FAD3的作用下生成亚麻酸，亚麻酸在LOX酶的作用下生成茉莉酸的前体物质^［31］。目前常见的高油酸花生品种，是由于FAD2的突变导致油酸到亚油酸的转化通路受阻，因此直接导致茉莉酸的含量减少。而AhFAB2-2的启动子元件中有茉莉酸甲酯反应元件，因此研究人员推测高油酸品种花生种子发育后期AhFAB2-2表达量减少可能与茉莉酸的合成有关^［8］，但二者是否存在这种联系还有待进一步验证。

为了探究AhFAB2-2基因对于花生油酸含量的调控作用与油料组成成分的改良效果，本研究对其进行了生物信息学分析，并成功构建了过表达载体pCAMBIA3301-FAB2-2，为后续功能研究奠定基础。

本文引用格式

吴秋霖，张君，韩笑，等.花生AhFAB2-2生物信息学分析、克隆及过表达载体的构建［J］.吉林农业大学学报，2026，48（1）：36-45.

参考文献

上下滑动查看更多

1. 田海莹. 花生油脂合成途径相关lncRNAs及关键基因的功能研究［D］. 济南：山东大学， 2022.

2. White J A， Todd J， Newman T， et al. A new set of Arabidopsis expressed sequence tags from developing seeds. the metabolic pathway from carbohydrates to seed oil［J］. Plant Physiology， 2000， 124（4）： 1582-1594.

3. Baud S， Lepiniec L. Physiological and developmental regulation of seed oil production［J］. Progress in Lipid Research， 2010， 49（3）： 235-249.

4. 王昊一，李宇玲，朱乐，等. 油菜种子休眠性对脂肪酸积累的影响及其分子机制［J］. 浙江大学学报（农业与生命科学版）， 2017， 43（4）： 397-403.

5. 王昊一. 油菜种子脂肪酸消减基因的功能解析及含油量相关基因发掘［D］. 杭州：浙江大学， 2021.

6. Shilman F， Brand Y， Brand A， et al. Identification and molecular characterization of homeologous Δ9‑stearoyl acyl carrier protein desaturase 3 genes from the allotetraploid peanut （Arachis hypogaea）［J］. Plant Molecular Biology Reporter， 2011， 29（1）： 232-241.

7. Liu H， Li H， Gu J， et al. Identification of the candidate proteins related to oleic acid accumulation during peanut （Arachis hypogaea L.） seed development through comparative proteome analysis［J］. Int J Mol Sci， 2018， 19（4）： E1235.

8. 刘浩，鲁清，李海芬，等. 花生硬脂酰‑ACP酸脱饱和基因FAB2表达的分子机制［J］. 作物学报， 2019， 45（11）： 1638-1648.

9. 徐平丽，唐桂英，毕玉平，等. 花生AhFAD2基因抑制表达的转基因后代分析［J］. 生物工程学报， 2018， 34（9）： 1469-1477.

10. 邓咪咪，刘宝玲，王志龙，等. 大豆硬脂酰‑ACPΔ9脱氢酶（GmSAD）基因家族的鉴定及功能分析［J］. 生物工程学报， 2020， 36（4）： 716-731.

11. 贾艳丽，吴磊，卢长明. 甘蓝型油菜Δ9硬脂酰ACP脱氢酶（SAD）基因的克隆与表达分析［J］. 中国油料作物学报， 2014， 36（2）： 135-141.

12. Craig W， Lenzi P， Scotti N， et al. Transplastomic tobacco plants expressing a fatty acid desaturase gene exhibit altered fatty acid profiles and improved cold tolerance［J］. Transgenic Research， 2008， 17（5）： 769-782.

13. 蔡曼. 棉花GhSAD2基因的克隆与功能验证［D］. 石河子：石河子大学， 2017.

14. 周瑢，刘盼，黎冬华，等. 芝麻硬脂酸脱饱和酶基因SiSAD的克隆及功能验证［J］. 中国农业科学， 2019， 52（10）： 1678-1685.

15. 马建忠，傅幼英，刘丹. 菠菜硬脂酰基载体蛋白去饱和酶（SAD）基因的分子克隆［J］. 农业生物技术学报，1996（1）： 33-37.

16. 范妙华. 千年桐硬脂酸脱饱和酶、油酸脱氢酶基因克隆及真菌遗传转化研究［D］. 北京：中国林业科学研究院， 2008.

17. Kachroo A， Shanklin J， Whittle E， et al. The Arabidopsis stearoyl‑acyl carrier protein‑desaturase family and the contribution of leaf isoforms to oleic acid synthesis［J］. Plant Molecular Biology， 2007， 63（2）： 257-271.

18. Gao L C， Sun R H， Liang Y X， et al. Cloning and functional expression of a cDNA encoding stearoyl‑ACP Δ9‑desaturase from the endosperm of coconut （Cocos nucifera L.）［J］. Gene， 2014， 549（1）： 70-76.

19. 李元杰，刘璐，周如军，等.花生疮痂病菌ISSR‑PCR反应体系的建立和优化［J］.吉林农业大学学报，2019，41（2）：142-148.

20. Rajwade A V， Kadoo N Y， Borikar S P， et al. Differential transcriptional activity of SAD FAD2 and FAD3 desaturase genes in developing seeds of linseed contributes to varietal variation in α‑linolenic acid content［J］. Phytochemistry， 2014， 98： 41-53.

21. Ramesh A M， Kesari V， Rangan L. Characterization of a stearoyl‑acyl carrier protein desaturase gene from potential biofuel plant， Pongamia pinnata L.［J］. Gene， 2014， 542（2）： 113-121.

22. Shah F H， Rashid O， San C T. Temporal regulation of two isoforms of cDNA clones encoding delta 9‑stearoyl‑ACP desaturase from oil palm （Elaies guineensis）［J］. Plant Science， 2000， 152（1）： 27-33.

23. Slocombe S P， Cummins I， Jarvis R P， et al. Nucleotide sequence and temporal regulation of a seed‑specific Brassica napus cDNA encoding a stearoyl‑acyl carrier protein （ACP） desaturase［J］. Plant Mol Biol， 1992， 20（1）： 151-155.

24. Thambugala D， Cloutier S. Fatty acid composition and desaturase gene expression in flax （Linum usitatissimum L.）［J］. Journal of Applied Genetics， 2014， 55（4）： 423-432.

25. Zaborowska Z， Starzycki M， Femiak I， et al. Yellow lupine gene encoding stearoyl‑ACP desaturase： Organization， expression and potential application［J］. Acta Biochim Pol， 2002， 49（1）： 29-42.

26. Zhao N， Zhang Y， Li Q Q， et al. Identification and expression of a stearoyl‑ACP desaturase gene responsible for oleic acid accumulation in Xanthoceras sorbifolia seeds［J］. Plant Physiology and Biochemistry， 2015， 87： 9-16.

27. Liu Q， Singh S P， Green A G. High‑stearic and high‑oleic cottonseed oils produced by hairpin RNA‑mediated post-transcriptional gene silencing［J］. Plant Physiology， 2002， 129（4）： 1732-1743.

28. Kachroo A， Lapchyk L， Fukushige H， et al. Plastidial fatty acid signaling modulates salicylic acid‑ and jasmonic acid‑mediated defense pathways in the Arabidopsis ssi2 mutant［J］. Plant Cell. 2003， 15（12）： 2952-2965.

29. Joern K， Hanna F， Stefanie S， et al. Two fatty acid desaturases， stearoyl‑acyl carrier protein δ9‑desaturase6 and fatty acid desaturase3， are involved in drought and hypoxia stress signaling in Arabidopsis crown galls［J］. Plant Physiology， 2014， 164（2）： 570-583.

30. 刘蕾，杜海，唐晓凤，等. MYB 转录因子在植物抗逆胁迫中的作用及其分子机理［J］. 遗传， 2008， 30（10）： 1265-1271.

31. Wasternack C， Song S S. Jasmonates： Biosynthesis， metabolism， and signaling by proteins activating and repressing transcription［J］. Journal of Experimental Botany， 2017， 68（6）： 1303-1321.

请点击下方二维码阅读期刊全文

期刊简介

《吉林农业大学学报》创刊于1979年，是吉林农业大学主办，由吉林省教育厅主管的农业综合类学术期刊，双月刊，国内外公开发行。《吉林农业大学学报》现为中国科学引文数据库（CSCD）收录期刊、北大核心期刊、中国科技核心期刊、中国核心学术期刊（RCCSE）A类期刊、中国农业工程领域高质量科技期刊分级目录T2级期刊、中国农业期刊集群创始成员刊、中国农业期刊最具传播力期刊。本刊已被《中国科学引文数据库》、《中文期刊全文数据库》、《中国科学技术期刊文摘（CSTA）数据库》、《中国学术期刊综合评价数据库》、《世界期刊影响力指数报告（WJCI）》、英国《国际农业与生物科学研究中心文摘》（CABI）、美国《化学文摘》(CA)、美国《农业文献题录》（B of A）、美国《国际药学文摘》（IPA）、英国《动物学记录》（ZR）、俄罗斯《文摘杂志》（AJ）等20多种国内外著名检索刊物及文献数据库摘引和全文收录。主要刊登作物栽培、遗传育种、植物保护、生物工程、生物技术、资源与环境科学、园艺科学、药用植物、中药学、动物科学与动物医学、食品科学与工程、农业工程、信息技术等学科及相关交叉学科的学术论文和文献综述等。读者对象是广大的科技工作者、高等院校的教师与研究生等。