Microbiome | 北京大学现代农业研究院:芹菜素的双重功能:抑制辣椒疫霉菌与调控辣椒微生物组
背景：植物对土传病原体的抗性由宿主遗传特性、根系分泌物及根际微生物组的互作共同塑造。黄酮类化合物因其抗菌与信号传导功能被广泛认知，但其在辣椒（Capsicum frutescens）中介导代谢物-微生物组-病原体互作的作用机制尚不明确。结果：通过整合微生物组、转录组与代谢组分析，我们比较了辣椒根际在疫霉菌（Phytophthora capsici）侵染下抗性品种（CA53）与感病品种（CA476）的差异。抗性植株的转录与代谢谱保持相对稳定，而感病植株的黄酮生物合成通路显著受抑，其中芹菜素水平急剧下降。外源施加芹菜素可通过破坏孢子囊细胞膜完整性（游动孢子释放量减少95%）显著增强辣椒抗性。此外，芹菜素作为枢纽代谢物，选择性富集了具有抑病功能的根际微生物，从而强化宿主防御。结论：本研究揭示了芹菜素在辣椒抗性中的双重作用：直接抑制病原体增殖，间接促进保护性微生物组的招募。这些发现凸显了根系代谢物在调控植物-微生物组互作中的生态功能，为基于代谢物的可持续作物保护策略提供了潜在路径。篇名: Dual functions of apigenin in suppressing Phytophthora capsici and shaping the pepper microbiomeDOI: 10.1186/s40168-026-02386-w本研究选用辣椒抗病材料CA53和感病材料CA476。采用离体叶片接种和整株灌根法接种辣椒疫霉菌孢子悬浮液，评估发病情况。通过原位水培法收集根系分泌物与根组织，经70%甲醇提取后进行UPLC-MS/MS广靶及靶向代谢组学分析。同时采用16S rRNA基因扩增子测序技术对根际土样进行扩增子测序及生物信息学分析。此外，以芹菜素等黄酮类化合物进行外源处理，结合转录组测序、细胞膜完整性及通透性测定，解析相关机制。(1)辣椒品种对疫霉菌抗性的筛选及根际微生物组与根系代谢物在抗性调控中的作用探究为评估抗性差异，我们通过离体叶片接种和整株接种试验对16个辣椒品种进行了疫霉菌抗性筛选，鉴定出8个抗病品种和8个感病品种（图S1，表S1）。其中，CA53和CA476分别在体内和体外实验中表现出稳定的抗病与感病表型。由于CA53与CA476均属于同一物种（Capsicum frutescens），因此我们选择抗病品种（CA53）和感病品种（CA476）进行后续研究（图1A）。整株接种试验显示，CA53的平均病情指数（DI）为31%，而CA476为73%（图1B）。离体叶片接种试验中，CA53的平均病斑面积为86.64 mm²，CA476为345.78 mm²（图S1）。这些结果证实CA53具有抗性，而CA476对疫霉菌高度敏感。为探究辣椒品种的抗病性是否受根际微生物组和根系代谢物影响，我们开展了抗病与感病品种的共培养实验。当两者共同生长时，感病植株接种疫霉菌后的病情指数较常规单作条件显著降低78.08%，表明抗病品种可通过根际相关机制增强感病植株的防御能力。值得注意的是，共培处理的病情指数甚至低于单独种植的抗病品种，这可能源于挥发性有机物（VOC）介导的信号传导重编程邻近植株的根系分泌，并放大根际微生物的抑病效应，使其超越单一品种的抗性水平[30]。微生物组移植实验进一步证实，将抗病品种的根际微生物群落转移至感病品种可抑制病害发展，其病情指数较单作降低27.40%，但效果弱于共培处理（图1C）。这一差异表明，除微生物作用外，抗病品种的根系分泌物可能在调控感病植株抗性中发挥关键作用。图1 辣椒对疫霉菌接种及微生物相关处理的病害响应。（A）抗病与感病辣椒品种接种后的表型特征。比例尺=5厘米。（B）图A中两个品种（抗病vs感病）接种后的病情指数统计分析。（C）共培养与微生物移植处理下辣椒的病情指数。不同小写字母（a、b）表示处理间存在显著差异（P<0.05）。我们首先比较了抗病与感病品种根际微生物群落的差异。抗病品种的根际微生物群落丰富度指数显著高于感病品种（图2A），表明抗病品种可能拥有更丰富的潜在有益类群，其稳定性可能有助于病害抑制。然而，Shannon和Simpson指数在两组间无显著差异，说明疫霉菌接种并未显著影响任一品种根际细菌群落的多样性。基于Bray-Curtis距离的主坐标分析（PCoA）显示，抗病品种CA53在接种前后其根际微生物群落未出现明显分离；而感病品种CA476则表现出明显的群落组成变化（图2B）。这些结果表明接种对抗病品种根际微生物组影响甚微，但显著改变了感病品种的微生物组成。抗病与感病品种的根际微生物网络也存在显著差异（图2C）。接种后，抗病品种CA53的微生物网络节点数、边连接性、负关联比例、平均度数和模块化程度均有所增加；而感病品种CA476的这些指标则呈现下降趋势（表S2）。具体而言，抗病品种的节点数、边数和负边数分别增加了11.24%、37.17%和79.13%；而感病品种则相应减少了15.10%、20.83%和33.57%。这表明病原菌入侵增强了抗病品种根际微生物网络的复杂性，却降低了感病品种的网络复杂度。已有研究表明，更高的微生物网络复杂性和负关联比例通常有助于群落应对外界压力时的稳定性和恢复力[31-33]。因此，抗病品种强化且更复杂的网络结构可能提供了抵御病原干扰的缓冲能力，从而维持持续的病害抗性。(3)抗病与感病辣椒品种根系分泌物的比较代谢组学分析为深入阐明抗病辣椒品种对疫霉菌感染的抑制机制，我们采用广靶代谢组学方法比较分析了CA53和CA476接种疫霉菌后的根系分泌物。通过UPLC-MS/MS共鉴定出1041种根系分泌物代谢物（图2F、G和表S3）。根系代谢物与分泌物的聚类分析显示，接种疫霉菌后抗病品种CA53与感病品种CA476存在明显区分（图2D、E）。代谢组学数据的主成分分析（PCA）表明，抗病品种CA53的根系代谢物和分泌物在接种前后均呈现高度相似的聚类模式（图2D）；而感病品种CA476则在接种后表现出明显的聚类分离（图2E）。这些发现提示病原感染对抗病品种CA53的代谢状态影响甚微，表明其防御相关代谢网络可能预先存在或能快速重建稳定性；相反，感病品种CA476在接种后经历了显著的代谢紊乱，这可能削弱其抗病能力。根系及分泌物代谢物的热图分析显示，与感病品种相比，抗病辣椒品种在疫霉菌感染后多个代谢通路表达上调，包括酚酸类、氨基酸及其衍生物、黄酮类生物合成以及核苷酸相关通路。值得注意的是，黄酮类生物合成通路在抗病品种的根系代谢物和分泌物中均持续富集（图2F、G），表明黄酮类化合物可能在增强病原抗性中发挥核心作用。图2 接种后抗病与感病辣椒品种根际微生物组及代谢物变化。（A）根际微生物群落的α多样性指数（Shannon、Simpson和Richness）。（B）根际微生物群落结构的主坐标分析（PCoA）。（C）四组处理（CA53CK、CA53PC、CA476CK、CA476PC）的根际微生物共现网络。CK：对照处理；PC：疫霉菌接种处理。不同颜色节点代表不同细菌门，红线表示正相关，绿线表示负相关。（D）广靶根系代谢物的主成分分析（PCA）。（E）广靶根系分泌物的PCA。（F）根系代谢物热图。（G）根系分泌物热图。RM表示对照组的根系代谢物，RP表示病原接种组的根系代谢物，RSM表示对照组的根际分泌物，RSP表示病原接种组的根际分泌物。不同小写字母（a、b）表示处理间存在显著差异（P<0.05）。(4)转录组-代谢组联合分析揭示黄酮类介导的抗病机制为验证这一假设，我们在接种后2天和4天分别对抗病品种CA53和感病品种CA476进行了转录组测序（RNA-seq）。结果显示，黄酮类生物合成相关基因在CA53中普遍上调，而在CA476中下调（图S2 A-F），进一步支持了抗性通过激活黄酮类生物合成途径介导的假说。为阐明抗病（R）与感病（S）辣椒品种响应疫霉菌感染的黄酮类代谢差异，我们整合了代谢组学和基于RNA-seq的转录组学分析。通过结合黄酮类代谢物谱与黄酮类生物合成基因表达数据，构建了展示其相互关联的关系网络。结果表明，感染后抗病与感病辣椒品种在黄酮类生物合成相关基因表达上存在显著差异。具体而言，7个苯丙氨酸解氨酶（PAL）基因和7个4-香豆酰辅酶A连接酶（4CL）基因在抗病品种中显著上调而在感病品种中下调，提示增强的苯丙烷代谢可能为下游黄酮类合成提供前体。8个查尔酮合成酶（CHS）基因在抗病植株中轻微下调，但在感病植株中表现出更强且广泛的抑制。黄酮合成酶（FNSⅠ/FNSⅡ）基因在抗病品种中呈现先降后升的表达模式（接种2天短暂下调，4天上调），而在感病品种中则持续受到抑制（图3A）。这些表达模式共同表明，黄酮类生物合成途径的激活对抗病辣椒抵御疫霉菌感染具有关键作用。通过比较抗病（R）与感病（S）品种响应疫霉菌感染的黄酮类代谢物谱，我们筛选出6种显著变化的黄酮类化合物进行深入分析：芹菜素-5-O-葡萄糖苷、圣草酚-7-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-新橙皮糖苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-新橙皮糖苷和木犀草素-7-O-芸香糖苷（图3B）。随后通过靶向代谢组学分析证实了这些化合物及其前体（芹菜素和木犀草素）与其他结构类似衍生物在根系分泌物中的动态变化。结果显示，抗病辣椒中芹菜素、木犀草素及其糖苷衍生物（包括芹菜素-5-O-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷和芹菜素-7-葡萄糖苷）显著积累，而感病品种感染后未观察到明显变化。其中芹菜素和木犀草素分别增加约111倍和68倍，其他衍生物增幅达143倍、328倍和227倍（图S3）。这些发现表明，黄酮类化合物（特别是芹菜素、木犀草素及其糖苷衍生物）的积累在辣椒抵御疫霉菌的防御反应中起着关键作用。图3 疫霉菌感染后黄酮类生物合成基因差异表达及代谢物变化。（A）响应疫霉菌感染的33个差异表达基因（DEGs）在黄酮类生物合成通路（KO00941）中的表达路径。热图显示33个DEGs在抗病（R）与感病（S）材料中的表达模式，白色至红色表示上调，蓝色表示下调。热图表达值经lg标准化，每个样本设三个生物学重复。（B）六种黄酮类化合物（芹菜素-5-O-葡萄糖苷、圣草酚-7-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-新橙皮糖苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-新橙皮糖苷和木犀草素-7-O-芸香糖苷）在不同实验组的箱线图。RSM表示对照组的根际分泌物，RSP表示病原接种组的根际分泌物。不同小写字母（a、b）表示处理间存在显著差异（P<0.05）。(5)黄酮类介导的抗病与感病辣椒根际微生物互作调控机制研究观察到黄酮类积累在辣椒抵御疫霉菌的防御反应中起关键作用。为深入阐明黄酮类介导的防御如何与根际微生物动态协同赋予抗性，我们分析了病原菌接种后根际微生物标志物的组成及其互作网络。接种后，抗病与感病品种间呈现显著差异的根际微生物群落结构，表明微生物对病原入侵存在适应性响应。通过LEfSe（线性判别分析效应量）分析鉴定关键类群，结果显示标志菌存在明显分化：抗病品种CA53中链霉菌属（Streptomyces）、假田野杆菌属（Pseudolabrys）和短波单胞菌属（Brevundimonas）显著富集；而感病品种CA476则以假单胞菌属（Pseudomonas）、固氮螺菌属（Azospirillum）和博德特菌属（Bordetella）为主。值得注意的是，CA53中的链霉菌属和CA476中的假单胞菌属具有最高的LDA评分，提示其可能分别作为抗病或感病的关键决定因子（图4A）。为探究代谢物与微生物的互作关系，我们整合五种化合物（木犀草素、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、芹菜素、芹菜素-7-O-葡萄糖苷和芹菜素-5-O-葡萄糖苷）的靶向检测数据与微生物组谱，构建了跨域生态网络（IDEN）。分析鉴定出89个与这些代谢物相关的ASVs（扩增子序列变体），涵盖29个属（图4B）。所有五种化合物均处于网络枢纽位置，且彼此间呈显著正相关（图4C、D）。此外，品种特异性微生物标志物也与这些代谢物显著关联：抗病品种CA53中所有链霉菌属ASVs均与代谢物正相关；而感病品种CA476中假单胞菌属ASVs则呈负相关（图4B）。该模式表明在CA53中，链霉菌可能协同根系分泌代谢物（如芹菜素衍生物）增强抗病性；而在CA476中，假单胞菌可能作为疫霉菌的"辅助微生物"，其丰度受代谢物积累抑制，从而削弱其促病作用。实证研究表明，黄酮类可作为化学信号调控根际微生物趋化性与定殖。不同黄酮类物质可差异性塑造微生物招募与群落组装[34,35]。为明确各类黄酮对微生物互作的差异贡献，我们进行了子网络分析。结果显示，与木犀草素及其糖苷衍生物相比，芹菜素及其两种糖苷形式关联的ASVs数量显著更多（图4E），表明芹菜素相关化合物可能与根际微生物群存在更广泛的潜在互作，凸显其在介导辣椒-微生物互作抵抗疫霉菌中的突出作用。图4 疫霉菌接种后微生物群落与代谢物的网络分析。（A）线性判别分析效应量（LEfSe）显示疫霉菌接种后抗病品种CA53（绿色）与感病品种CA476（橙色）间差异富集的微生物类群，LDA评分表示类群差异的效应量。（B）跨域生态网络（IDEN）展示目标代谢物（标记节点如木犀草素、芹菜素及其糖苷）与扩增子序列变体（ASVs，彩色节点）的关联。红线表示正相关，绿线表示负相关，节点颜色区分网络角色（如绿色节点为网络枢纽）。（C）模块内连接度（Zi）与模块间连接度（Pi）的散点图，将微生物节点分类为网络角色（外围节点、模块枢纽、连接节点、网络枢纽）。(6)芹菜素通过抑制疫霉菌游动孢子释放增强辣椒抗病性为验证芹菜素、木犀草素和芹菜素-7-葡萄糖苷对疫霉菌游动孢子形成的抑制作用，研究人员开展了系列实验。结果显示，三种测试的黄酮类化合物均能显著减少游动孢子产量，其中芹菜素效果最为突出，可使游动孢子数量较对照组减少90%（图S4A、B及补充视频1-4）。这些发现证实芹菜素能有效抑制游动孢子释放，从而中和病原菌的主要侵染源。鉴于其最强抑制效果及在抗病品种中的显著诱导表达，芹菜素被选为主要候选分子进行后续功能验证。在感病品种CA476的离体叶片实验中，三种黄酮类化合物（芹菜素、木犀草素和芹菜素-7-葡萄糖苷）预处理后接种疫霉菌游动孢子（10⁵孢子/mL），仅芹菜素能显著减小病斑面积（图S4C、D）。与游动孢子释放实验结果一致，芹菜素在测试化合物中表现最优，因此进一步开展体内验证。靶向定量代谢组分析显示，抗病品种CA53在自然条件下根际分泌的芹菜素浓度约为2 μg/mL。基于此浓度，研究人员设置了0.5-4 μg/mL的剂量梯度进行剂量效应实验（图S5）。结果表明1和2.5 μg/mL的芹菜素能提供最强保护效果（图S5）。整株接种实验显示，用1或2.5 μg/mL芹菜素预处理CA476根部后接种游动孢子（10⁵孢子/mL），可使7天后的病情指数（DI）从80%降至35%，并显著抑制根坏死进程（图5A、B）。这些结果共同证明芹菜素能有效抑制疫霉菌致病过程并显著增强辣椒对疫病的抗性。为探究芹菜素抑制游动孢子释放的机制，研究人员在游动孢子诱导阶段分别添加1 μg/mL和2.5 μg/mL芹菜素，并通过光学显微镜动态观察（图5C、D及补充视频5-8）。基于空孢子囊（红色箭头标记）的定量分析显示，芹菜素处理显著降低了空孢子囊比例，同时未释放（黄色箭头）和正在释放（绿色圆圈）的孢子囊数量也同步减少，且抑制效果随浓度增加而增强（图5E、F）。在游动孢子诱导阶段，研究人员评估了芹菜素处理对细胞膜完整性和通透性的影响。与对照相比，经1、2.5和5 μg/mL芹菜素处理的菌丝呈现强烈绿色荧光，且荧光强度显著增强，表明膜完整性受损（图5G）。电导率测定结果证实，芹菜素处理后疫霉菌丝膜通透性显著增加（图5H）。此外，芹菜素处理通过促进甘油生物合成和胞内甘油积累有效激活渗透调节机制（图5I）。这些发现共同表明，芹菜素可能通过靶向膜功能、破坏膜通透性和渗透稳态来抑制疫霉菌游动孢子释放。图5 芹菜素通过抑制游动孢子释放及改变细胞膜通透性提高感病辣椒对疫霉菌的抗性。（A）不同浓度芹菜素对感病辣椒（CA476）疫霉菌抗性表型的影响。比例尺=5厘米。（B）接种疫霉菌前施用芹菜素的辣椒病情指数。误差线表示三个重复的标准差。（C）不同浓度芹菜素对游动孢子释放的影响。（D）芹菜素处理后游动孢子释放的统计分析。（E）芹菜素处理后疫霉菌孢子囊的表型特征分析：空孢子囊（红色箭头标注）、未释放孢子囊（黄色箭头）及正在释放游动孢子的结构（绿色圆圈）。比例尺=100微米。（F）空孢子囊的定量分析。（G）SYTOXTM Green染色评估芹菜素处理后的疫霉菌菌丝。比例尺=100微米。（H）芹菜素处理后疫霉菌电导率的测定。（I）芹菜素处理后疫霉菌甘油含量的测定。不同小写字母（a、b）表示处理间存在显著差异（P<0.05）。(7)转录组分析揭示芹菜素靶向膜通透性与ABC转运蛋白的作用机制为深入探究芹菜素抑制疫霉菌游动孢子释放的分子机制，本研究对芹菜素处理后的菌丝在游动孢子释放阶段进行了转录组测序与分析。共鉴定出28,579个基因，其中1,535个差异表达基因（DEGs）包含276个上调基因和1,259个下调基因（图6A）。KEGG通路富集分析显示，这些差异基因显著富集于ABC转运蛋白通路（图6B）。ABC（ATP结合盒式）转运蛋白是参与多种底物转运的关键跨膜组分[36]，通过介导有毒化合物外排和促进宿主适应，在微生物致病过程中发挥重要作用。它们既能清除有毒化合物和各类杀菌剂[37]，某些ABC转运蛋白还可直接作为毒素受体[38]。此外，原核生物的ABC转运蛋白通过高效获取宿主营养促进生长和致病性来增强毒力[39]。在31个与ABC转运蛋白相关的差异基因中，共涉及6个亚家族：ABCG5（11个DEGs）、ABCG2（3个DEGs）、ABCC4（1个DEG）、ABCC1（9个DEGs）、ABCB1（2个DEGs）和ABCA3（4个DEGs）（图6C）。值得注意的是，这些基因大多呈现下调表达模式。GO富集分析进一步显示：在细胞组分（CC）类别中，差异基因显著富集于整合膜组分、内在膜组分及膜相关区域等条目；在分子功能（MF）类别中，则显著富集于转运活性和跨膜转运活性相关条目（图6D）。该结果表明芹菜素可能通过调控ABC转运蛋白系统的表达来影响病原菌的膜通透性和物质转运功能，从而抑制其游动孢子的释放过程。图6 芹菜素处理后疫霉菌的转录组分析。（A）芹菜素处理条件下疫霉菌差异表达基因（DEGs）的火山图。（B）芹菜素处理后疫霉菌差异表达转录本的KEGG通路富集分析。（C）对照条件与芹菜素处理下31个ABC转运蛋白编码基因表达谱的热图分析。（D）芹菜素处理后疫霉菌差异表达转录本的GO功能富集分析。本研究证实芹菜素是一种具有多重功能的代谢物，既能直接抑制病原菌繁殖，又能间接促进有益根际微生物群落的建立（图7）。通过整合转录组学、代谢组学和微生物组分析，我们阐明了植物源代谢物如何作为核心节点，在宿主防御、微生物招募和病害抑制的互作网络中发挥关键作用。这些发现不仅深化了我们对代谢物-微生物-病原菌互作机制的理解，更为利用天然化合物实现作物可持续保护提供了新思路。
